Streptomyces Avermitilis NEAU1069生物合成多拉菌素（Doramectin）基因簇克隆和关键基因功能分析

课题组2005年发现了杀虫抗生素多拉菌素新产生菌S. Avermitilis NEAU1069，与已完成全基因组测序产阿维菌素、多拉菌素的工业化菌株S. avermitilis比较，它们的代谢特性和产物明显不同，新菌株仅生物合成少量3个阿维菌素化合物，而合成较多的多拉菌素，并鉴定出9个新结构化合物，新菌株更适合工业化生产多拉菌素。为揭示新菌株生物合成多拉菌素的途径，构建菌株基因组文库，根据报道的生物合成阿维菌素基因设计引物，菌落PCR从文库中筛选阳性克隆，测序并组装，绘制出新菌株生物合成多拉菌素基因簇连锁图并比较基因簇中差异基因；利用已建立的高效遗传操作体系，通过体内基因敲除与回补、体外蛋白表达与酶促分析、产物分离与结构解析，阐明关键差异基因功能和合成途径。从源头上认识新菌株生物合成多拉菌素机理，可能会发现新的生物合成机制，并对提高产多拉菌素能力和调控水平有重要理论指导意义和工程应用价值。

按计划完成项目的预期研究计划和目标。. 为了提高新菌株S. avermitilis neau 1069生物合成多拉菌素的单位产量，揭示与国外阿维链霉菌菌株代谢多拉菌素特性的差异。诱变、合理选育获得了在50 L罐发酵中产多拉菌素单位产量稳定在870±58 mg/ml的高产菌株，表现出了良好的产多拉菌素潜能。克隆S. avermitilis neau 1069生物合成多拉菌素基因簇，全长为144.5 kb，而国外报道的S. avermitilis基因簇全长仅82 kb，且一些相同功能基因的位置不同。S. avermitilis neau 1069生物合成多拉菌素基因簇中起始单元AT基因与国外报道生产用的野生菌株S. avermitilis ATCC31272的蛋白一致性仅为82%，可能是S. avermitilis neau1069菌株多的生物合成多拉菌素的重要原因。定量RT-PCR分析在菌体生长过程中阿维菌素生物合成前体二甲基丁酸、异丁酸的关键酶α-酮酸脱氢酶（BCDH）基因转录水平，发现S. avermitilis neau 1069中该基因的转录水平始终低于S. avermitilis ATCC 31272七倍以上，这是S. avermitilis neau 1069少的生物合成阿维菌素特性的缘故。而两个菌株生物合成基因簇中的调控dorC基因与aveC基因的关键核苷酸差异，是S. avermitilis neau1069生物合成与多拉菌素结构仅在C25位有差异，在提取纯化过程中极难分离的杂质CHC-B2较多的重要原因。点突变S. avermitilis neau 1069生物合成多拉菌素基因簇中的dorC基因，明确了不同dorC基因序列影响多拉菌素与CHC-B2生物合成比例。定点突变dorC基因中11个氨基酸残基并同源重组，获得了极少生物合成杂质CHC-B2的优良、高产基因工程菌，发酵单位产量稳定在3700mg/ml以上，比野生菌株的9 mg/ml提高411倍。突破了国内外的菌株因多拉菌素单位产量少，而生物合成在生产中极难分离除去的阿维菌素、CHC-B2多，不易工业化生产的关键技术。. 发表SCI论文4篇。