基于低溶点共熔溶剂的甾体化合物高效微生物全细胞催化脱氢体系研究

In microbial steroid transformation, the poor solubility of steroids in aqueous media seriously limits the productivity of biotransformation systems. Deep eutectic solvents (DESs) as green solvents which are helpful to improve the solubility of the substrate in water system therefore can be used to solve this problem. In this project, biotransformation of steroids 1-en-dehydrogenation using Arthrobacter simplex in DESs containing system is used as a model, and the effects of DESs on the growth and integrity of A. simplex, as well as the steroid 1-en-dehydrogenation, were investigated，thus the correlation between the components, physicochemical properties of DESs and physiology and biochemical characteristics of A. simplex cells in different DESs-containing system was elucidated. Then, the law of DESs’ effect on the initial reaction rate, yields, and the solubility of various substrates in the reaction system will be summarized. The mechanism of DESs on steroids 1-en-dehydrogenation biotransformation by A. simplex can also be revealed by the following investigations on the effect of DES on the activity, stability, selectivity and molecular structure of the 3-Ketosteroid Dehydrogenases in A. simplex. The engineered A. simplex with high biocatalytic activity and the DES with higher substrate solubility and lower toxicity to microorganism were used to construct DES-containing system for efficient 1-en-dehydrogenation of steroids. These results will play fundament role in the potential application of DES-based systems for industrial efficient steroid biotransformation. These studies will also be very important for the other efficient industrial steroid production.

甾体化合物难溶于水导致生物转化效率偏低是甾体药物生物催化生产中急需解决的关键问题。新型绿色溶剂低熔点共熔溶剂（DES）可提高难溶性有机底物的溶解度，为提高甾体化合物生物催化效率提供一条新途径。本项目以简单节杆菌在DES体系中对甾体化合物的生物脱氢为研究对象，分析DES的物理、化学参数与菌体的生物相容性、生理特性之间的关系，考察低溶点共熔溶剂对于底物溶解、物质传递以及转化效率的影响，阐明DES对生物催化甾体化合物脱氢的影响规律；进一步解析DES体系中催化脱氢反应关键酶3-甾酮-Δ1-脱氢酶的空间结构与催化活性之间构效关系，揭示3-甾酮-Δ1-脱氢酶在DES体系中的催化机理，据此构建适用于DES体系的高效脱氢基因工程菌株。本项目将为理性筛选DES，构建甾体化合物高效全细胞生物催化脱氢体系提供必要的理论基础，对其他甾体化合物的高效生物催化生产也具有非常重要的实践意义。

甾体化合物难溶于水导致生物转化效率偏低是甾体药物生物催化生产中急需解决的关键问题。新型绿色溶剂低熔点共熔溶剂（DES）可提高难溶性有机底物的溶解度，为提高甾体化合物生物催化效率提供一条新途径。本项目通过考察含DESs体系中简单节杆菌的生长曲线、活菌数、胞外葡萄糖消耗量及细胞膜完整性，发现DES对细胞的毒性随DES浓度的增加而增加，且与氢供体的摩尔比呈正相关，其中ChCl:U对菌体较小的细胞毒性。利用GC-MS进一步研究了ChCl:U作用前后简单节杆菌胞内代谢水平的差异，并通过多元统计分析发现ChCl:U导致简单节杆菌代谢水平降低。提高甾体化合物C1,2位脱氢酶的催化活性是本项目拟解决的关键问题。本项目以来源于简单节杆菌的3-甾酮-Δ1-脱氢酶，对不同甾体化合物催化性能的分析，结合同源建模和分子动力学分析，研究其构效关系。利用定向进化和饱和突变技术，获得突变体W299A和W299G，其催化活性分别提高了88.24 %和63.21 %。进一步通过分子对接，结合分析催化过程自由能的变化，阐明甾体化合物C1,2位脱氢酶KsdD对不同甾体化合物的催化机理。由此构建高活性甾体化合物C1,2位脱氢酶基因工程菌，表现出较高的转化优势。系统评价DESs对来源于简单节杆菌的五个同功酶KsdD催化不同甾体药物的催化活性和催化效率的影响。结果表明，[ChCl][Gly]和[ChCl][Eg]均能促进KsdD4催化五种底物的催化活性和催化反应的生物转化率，为DESs在工业甾体药物生产中的应用奠定了重要的基础。通过细胞模型——脂质体模拟DESs对于细胞膜的影响。DESs及其组成成分的浓度与脂质体粒径值大小呈正比，根据激光共聚焦显微镜观察结果，DESs促进了脂质体抱团聚集。本项目首次报道了KsdD的固定化及其在ADD连续生产中的应用。固定化的W299A在4℃孵育30天后仍保持了初始活性的66.3%，并且比游离的KsdD更稳定，15个重复反应结束后，保持了初始活性的70.5%。对促进甾体制造业的绿色技术发展和生物催化剂的可持续使用具有重要意义。项目结束时，发表相关文章8篇，其中SCI 论文2篇，申请相关专利2项，授权2项。