L-型钙通道可变剪接在心衰合并心律失常发生机制中的作用及靶向干预

Electrical remodeling is one most important mechanism of malignant arrhythmia and Sudden cardiac death for heart failure patients. The role of structural and functional changes of ion channels caused by alternative splicing in the remodeling is still unclear. We previously identify one human specific splice variant of L-type calcium channel, which is highly expressed in the cardiac muscle of heart failure combined with arrhythmia patients. The splice variant inhibits calcium dependent inactivation of the channel, prolongs action potential duration and calcium transient. This project will further investigate the underlying mechanis of the effects that the variant has on cardiac arrhythmia during heart failure. The human iPS cell derived myocytes model generated by CRISPR/Cas9 technique, and the splice variant knock-in mouse models will be used to observe the effect of the variant on cardiac calcium signaling, contraction/relaxation, electrically remodeling, triggered activity and arrhythmia. In addition, we will screen the factors that control the regulation of this splicing events, and will further investigate how the variant affects channel inactivation via calmodulin. Lastly, we will use adeno-associated virus to selectively interfere the splice variant in cardiomyocytes, in order to improve calcium channel activities in hear failure model, so that to inhibit electrically remodeling and arrhythmia. The expected results will provide a new strategy for the prevention / treatment of sudden cardiac death of heart failure patients.

心肌电重构是心衰患者恶性心律失常和心源性猝死发生的重要机制。mRNA前体可变剪接所导致的通道蛋白结构和功能改变在心电重构中的作用还不十分清楚。我们前期发现L-型钙通道的一种人类特异的剪接变异体在心衰合并心律失常患者心肌高表达。该变异体抑制通道的钙依赖性失活，延长动作电位及钙瞬变时程。本项目拟进一步探讨该剪接变异体对心衰时心律失常的作用机制，应用CRISPR/Cas9技术建立其人iPS细胞分化的心肌细胞模型，以及该剪接变异体的小鼠定点敲入模型，观察其对心肌钙信号、舒缩活动、电重构，触发活动和心律失常的影响。此外，我们将筛查调控此可变剪接的信号分子，并深入探讨该剪接变异体通过钙调蛋白影响钙通道失活的机制。最后，我们将采用腺相关病毒载体进行心肌细胞选择性干扰该剪接变异体，从而改善心衰模型心肌的钙通道活性，抑制电重构和心律失常发生。预期结果将给心衰患者心源性猝死的防治提供一个新的策略。

心肌电重构是心衰患者恶性心律失常和心源性猝死发生的重要机制。mRNA前体可变剪接所导致的通道蛋白结构和功能改变在心电重构中的作用还不十分清楚。我们前期发现L-型钙通道的一种人类特异的剪接变异体（41A）在心衰合并心律失常患者心肌高表达，可能是心衰合并心律失常的潜在治疗靶点。为此，本项目以心衰患者心室肌、心脏41A过表达转基因小鼠、急性分离的心肌细胞、iPS分化的心肌细胞、以及HEK293工具细胞为研究对象，采用多种方法（CRISPR/Cas9编辑技术、膜片钳技术、共聚焦显微钙成像技术、光标测技术、以及ECG和心脏超声等），系统研究钙通道41A剪接亚型的表达和功能的调控规律，以及在iPS分化的心肌细胞以及转基因小鼠心脏中的意义。研究表明，心衰时候通过缺氧信号通路上调41A表达，41A影响钙通道C末端与apoCaM结合并抑制钙依赖性失活; 过表达41A的纯合子小鼠表现为窦性心动过缓，TAC手术后更容易诱发心衰; 而过表的41A的iPS分化的心肌细胞也表现显著的钙电流下降和动作电位延长，并容易诱发心律失常。该项目从一个新的角度阐释钙通道可变剪接与心衰合并心律失常的关系，从而为临床防治提供了新的思路。此外，在该项目的实施过程中，建立和完善了iPS分化心肌的纯化成熟方法，心律失常的细胞和整体水平电生理记录，以及光标测技术平台，为离子通道的研究提供了相对较完整的策略，有助于心脏电生理领域的进一步研究。