RpoS在荧光假单胞菌致水产品腐败过程中的作用及调控机制研究

Microorganism activities are considered as the main cause of aquatic product spoilage and lead to great losses during storage, processing and circulation of aquatic products. Pseudomonas fluorescens is the specific spoilage organism of multiple aquatic products with high spoilage activity. Study on the regulation mechanism of spoilage caused by bacteria is valuable to keep the quality and safety of aquatic products. RpoS is a conserved global transcriptional regulator found in many bacteria and can regulate both the survival ability under stress conditions and the generation of virulence factors. Thus it is very possible that RpoS plays a critical role in aquatic product spoilage caused by Pseudomonas fluorescens. In this project, we plan to study the role of RpoS in stress resistance, spoilage factor generation and in vivo spoilage activities in Pseudomonas fluorescens by gene knockout and overexpression. Subsequently, transcriptional difference of rpoS mutant and wild type will be analyzed by transcriptome sequencing to determine the downstream genes regulated by RpoS and the functions of these genes, and the promoter binding activity and direct target genes of RpoS will be studied by EMSA. Basing on the researches above, we aim to illuminate the role and regulation mechanism of RpoS regulator in aquatic product spoilage caused by Pseudomonas fluorescens to provide theoretical basis for targeting control of bacterial spoilage and effective technology development of aquatic product preservation.

微生物活动是引起水产品腐败的主要原因，造成水产品在贮藏、加工及流通过程中的巨大损失。荧光假单胞菌的腐败活性强，是多种水产品的特定腐败菌，探索其腐败调控机制对于水产品品质和安全控制具有重要的理论指导意义。RpoS是一个在细菌中保守存在的全局转录调控蛋白，调节细菌在不利环境下的存活力和毒力因子的产生，因此很可能在荧光假单胞菌致腐败过程中起到关键作用。本项目拟以荧光假单胞菌为研究对象，通过基因敲除和过量表达的方法研究RpoS在调控细菌环境耐受性、腐败因子产生和体内致腐败过程中的作用；通过转录组测序技术分析rpoS基因突变株和野生型转录水平差异，明确RpoS蛋白调控的下游基因及功能，采用EMSA技术研究RpoS蛋白的启动子结合活性及直接调控靶基因。以期阐明RpoS在荧光假单胞菌致水产品腐败过程中的作用及调控机制，为靶向控制细菌腐败作用和探索高效水产品保鲜技术提供理论基础。

微生物活动是引起水产品腐败的主要原因。荧光假单胞菌的腐败活性强，是多种水产品的特定腐败菌，探索其腐败调控机制对于水产品品质和安全控制具有重要的理论指导意义。本研究运用同源重组的方法构建荧光假单胞菌rpoS基因缺失突变株，比较野生型和突变株胁迫耐受性、腐败因子产生以及对鱼汁的腐败能力差异，确定RpoS在荧光假单胞菌致腐败过程中的作用；通过转录组测序和蛋白组测序技术分析rpoS基因突变株和野生型转录和蛋白水平差异，明确RpoS蛋白调控的下游基因及功能，并采用5’-RACE-PCR技术分析RpoS直接调控靶基因启动子。以期阐明RpoS在荧光假单胞菌致水产品腐败过程中的作用及调控机制。本项目主要研究结果如下：①成功构建了荧光假单胞菌标准菌株UK4和水产品分离株ZJL511的rpoS基因框内缺失突变株；②证实RpoS调节荧光假单胞菌对多种胁迫条件的耐受性；③证明RpoS对荧光假单胞菌群体感应信号分子AHLs的合成存在调控作用；④证实RpoS控制荧光假单胞菌大菌落生物被膜形成；⑤在灭菌三文鱼汁中的腐败活性检测表明rpoS基因缺失可导致荧光假单胞菌胞外蛋白酶活性和挥发性盐基氮的生成量显著降低；⑥RpoS在RNA水平和蛋白水平调控一系列基因的表达，这些基因主要参与多糖代谢、细胞间分泌和胞外结构、细胞壁合成、胁迫应激、氨及生物胺代谢。这些细胞过程可能有助于荧光假单胞菌生物被膜、胁迫耐受和腐败活性的产生，并且这些过程也可能受依赖于RpoS的一些转录因子和信号转导的调控；⑦在荧光假单胞菌中，RpoS直接调控靶基因的启动子-10区存在CTATACT类似序列。本项目的研究结果已发表SCI论文3篇，中文核心论文3篇，上述论文均标注本项目第一资助。本项目主要科学意义：确定了RpoS在荧光假单胞菌致水产品腐败过程中的重要调控作用及机制，对于靶向控制细菌腐败作用和探索高效水产品保鲜技术具有重要意义。通过本项目研究，本项目主持人入选浙江省卫生高层次创新人才、浙江省微生物学会青年委员会副主任委员、浙江省生物医学学会理事。综上所述，我们全面完成了本项目研究任务。