基于新机制双重调控βⅢ与P-gp针对耐药乳腺癌的先导物发现、优化及活性研究

Most of the advanced breast cancers eventually lead to treatment failure due to drug resistance. Microtubule-targeted drugs have been found to have two drug-resistant pathways: overexpression of βIII and P-gp; moreover, βIII overexpression is correlated with poor outcome in breast cancer. Focus on frontier in medicinal chemistry, the protein degradation targeting chimera technology (PROTAC) will be used in this project to explore the feasibility of finding drugs to overcome drug-resistant breast cancer with a novel mechanism of dual regulation of βIII and P-gp. Based on the backbone structure of βIII inhibitor and 3D-QSAR in our previous work, the βIII/P-gp protein ligand will be constructed rationally by the “self-built QSAR—P-gp virtual screening” method, and the PROTACs will be designed via appropriate selection of linkers and ubiquitin ligase ligands. The potent βIII/P-gp degraders will be acquired by western blotting study, antitumor activity of drug-resistant breast cancer cell lines and experimental animals and mechanism studies. Two scientific questions will be answered through this project: (1) What shapes of the molecular structure can have potent βIII/P-gp degradation property? (2) Is it an effective strategy to resolve drug resistance and improve prognosis with βIII/P-gp degraders? This project may contribute to discovery of anti-multidrug resistant breast cancer drugs.

晚期乳腺癌大多因出现耐药现象而最终导致药物治疗失败。已知微管类药物存在两条耐药途径：过表达βIII与P-gp；且过表达βIII产生不良预后。本项目聚焦前沿，独辟蹊径，采用蛋白降解靶向嵌合体技术（PROTAC）开展研究，旨在探索通过双重调控βIII与P-gp设计针对耐药乳腺癌药物的可行性。以前期发现βIII抑制剂骨架及3D-QSAR为基础，通过“自建QSAR—P-gp虚筛”方法合理构建βIII/P-gp蛋白配体，选取合适连接链及泛素连接酶配体，设计PROTAC分子。通过Western Blot、耐药乳腺癌细胞株、动物水平等一系列生物活性评价及机制研究，发现抗耐药乳腺癌的高效降解剂。通过本项目回答两个科学问题：（1）何种分子结构具有高效βIII与P-gp降解功能？（2）具有βIII与P-gp降解功能的PROTAC是否是一种有效解决耐药问题及改善预后的策略？为研发具有抗多药耐药乳腺癌药提供基础。

PROTAC是近年发展起来的药物研究理念，其在抗耐药及非成药性靶点的药物研发上具有较大优势。本项目基于蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）技术，通过选取合适的靶蛋白配体、连接链、泛素连接酶配体，设计并合成微管蛋白降解剂。.首先，构建微管蛋白配体库。设计并合成40个微管蛋白聚合抑制剂，发现几个纳摩尔级的高效抗肿瘤化合物（3-7 nM）。这些分子具有较好理化性质，有望继续开展深入的成药性评价工作。. 然后，选取其中化合物作为微管蛋白配体，设计、合成40个PROTAC分子，开展抗肿瘤活性及微管蛋白降解活性评价，并开展微管形态及细胞周期作用研究。我们发现连接链对PROTAC的抗肿瘤活性影响特别大。其中，多聚乙二醇连接链、及含有三氮唑的连接链较烷基链相比活性下降，并且连接链的长度对活性影响特别大。通过western blot实验，发现这些PROTAC分子的降解活性并不理想。对此，我们提出如下分析：PROTAC通过三元复合物发挥作用，由于蛋白自身维持稳态平衡及PROTAC的hook作用，配体亲和能力及跨膜吸收能力对不同靶蛋白降解的影响具有较大差异。对于含量低的靶蛋白，对配体亲和能力及跨膜吸收能力要求较低；对于含量高的蛋白，对配体亲和能力及跨膜吸收能力要求较高。PROTAC分子量大都超过500，与传统小分子药物相比，其跨膜吸收能力较弱。这需要我们不断通过配体及连接链的调整，优化分子的理化参数，发现新的方法理念来提高跨膜吸收能力。. 最后，我们意外发现，PROTAC一个配体分子TH320具有诱导细胞发生铁死亡作用，并通过电镜下线粒体形态、GPX4表达变化、过氧化物及铁含量变化上加以验证。通过本项目，我们获得一些有意义的研究成果并积累了大量PROTAC药物研究经验。