HUFA诱导草鱼脂肪细胞凋亡的作用及机制分析

Apoptosis (i.e. programmed cell death) serves as a major mechanism for regulation of cell numbers. The apoptosis of adipocytes plays a crucial role in animal lipid metabolism and energy homeostasis. Based on the phenomenon that highly unsaturated fatty acid (HUFA) could reduce the body's lipid accumulation, we will take grass carp (Ctenopharyngodon idellus), the unique carp species in China, as the animal model in this project. Cell culture, RNAi, realtime-PCR, Western Blot, and other biotechnological techniques,as well as some animal nutritional methods would be applied in vitro and in vivo. The aim of this project is to study the effects of different types and different contents of HUFA (eicosapentaenoic acid, EPA; docosahexaenoic acid, DHA) on apoptosis of adipocytes. Some indicators of apoptosis would be detected, including caspases proteases, Bcl-2 family proteins, TNF-α and other indicators which play a role during the apoptosis process. Through those indicators detected, we would define the specific apoptosis pathway induced by HUFA. The role of the regulators belonging to the mitochondrial apoptosis and TNF superfamily extracellular pathway would be explored scientifically. The results will provide reasons and thoughts in study for principle of controlling lipid metabolism and technology in freshwater fish. This project has the significance of theory and application.

细胞凋亡是动物机体调控细胞数量的重要机制，而脂肪细胞凋亡在动物脂质代谢和能量平衡调节过程中发挥着关键性的作用。基于高不饱和脂肪酸（HUFA）可降低动物机体脂质蓄积的现象，本项目拟以我国特有的鲤科鱼类草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为试验材料，采用离体细胞培养与在体饲喂、RNA干扰、流式细胞仪分析、免疫染色、实时定量PCR及Western blot等细胞和分子生物学技术，探究HUFA诱导草鱼脂肪细胞凋亡的作用，并通过检测细胞凋亡过程中caspase家族、Bcl-2家族、TNF-α等凋亡相关指标的变化情况，明确HUFA诱导凋亡作用的具体途径，深入探讨其作用产生过程中线粒体介由细胞凋亡的内源性凋亡通路和TNF受体途径等外源性凋亡通路的分子事件，系统分析其作用机制。研究结果将为淡水鱼脂质代谢调控原理及技术研究提供依据和研究思路，具有较大的理论和应用意义。

控制脂质蓄积在人类医学及动物营养生物学研究中是一个重要的课题。利用高不饱和脂肪酸（HUFA）诱导脂肪细胞凋亡是实现干预脂质蓄积的有效途径之一。本项目以草鱼为研究对象，克隆获得草鱼凋亡基因如caspase-3a、caspase-3b、caspase-8、caspase-9和AIF等的全长CDS，探讨了其在脂肪细胞分化过程中的表达规律。在此基础上，在体饲喂和离体（脂肪细胞培养）试验相结合，分析了HUFA（DHA、EPA和ARA）和ALA对草鱼前体脂肪细胞的影响。结果表明：①日粮中添加适量的 EPA（0.52%）通过促进甘油三酯水解、促进脂肪细胞凋亡、抑制脂肪酸从头合成等途径降低草鱼腹腔脂肪蓄积；ALA 本身可以促进成熟脂肪细胞凋亡，而对于前体脂肪细胞，ALA 可能通过其生物合成产物发挥作用;草鱼前体和成熟脂肪细胞在利用 ALA 合成 DHA 的能力上可能具有差异。②日粮中添加0.6% DHA，分别在饲喂3周和6周后可降低草鱼腹腔脂肪组织脂质蓄积，用200μM DHA分别处理脂肪细胞，Caspase3， Caspase 8和Caspase9酶活升高。同时添加GW9662（PPARγ抑制剂），能够缓解DHA诱导的草鱼脂肪细胞凋亡,表明DHA诱导草鱼前体脂肪细胞凋亡的作用与内源性、外源性途径凋亡及PPARγ介导的凋亡途径有关。③ARA 降低了细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡相关基因的表达，上调了脂质分解和胆汁酸合成相关基因的表达；同等浓度下，日粮 ARA 在调控脂质蓄积和脂代谢相关基因表达方面的作用强于 EPA。综上所述，n-3HUFA（DHA和EPA）及其前体ALA可诱导脂肪细胞凋亡，而ARA则不具有这方面的作用。本项目所获得的研究结果有助于丰富淡水鱼类脂质代谢及脂肪细胞发育理论，并将为养殖鱼类脂质蓄积的调控提供理论依据和研究思路，具有较大的理论和应用上的意义