PUFA对草鱼脂肪细胞线粒体发育的影响及其机制分析

本项目拟以我国特有的鲤科鱼类草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为试验材料，采用离体细胞培养、实时定量PCR及Western 杂交、酶活性测定等细胞和分子生物学技术及与在体饲喂方法相结合的手段，研究多不饱和脂肪酸（PUFA：包括亚油酸、亚麻酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸）作用下，草鱼脂肪细胞线粒体蛋白、膜组成、线粒体脂肪酸β-氧化能力和线粒体关键基因CPT、PGCs、NRF的表达以及线粒体氧化应激状态的变化，进行脂肪细胞发育的观察并研究其中的分子事件，探索PUFA对草鱼脂肪细胞线粒体发育状况及其功能的影响，进而从线粒体途径探讨外源性生理活性物质对脂肪细胞发育的作用及其机制。研究结果将为养殖鱼类脂质代谢调控提供理论依据和研究思路，具有较大的理论和应用上的意义。

本项目结合离体及在体试验，在个体、细胞、分子等多个水平探讨了PUFA对草鱼线粒体发育及关键基因表达、脂肪细胞分化转录因子表达、脂肪代谢酶活性及氧化应激状态等的影响。在克隆草鱼CPT-1、NRF-1、Bcl2、Caspase-3等8个基因的部分及全长序列的基础上，开展了三个饲养试验，首先根据项目组前期研究所获得的草鱼PUFA需求信息，设计并实施长期饲喂试验，研究PUFA对草鱼脂肪细胞线粒体相关指标的影响；随后研究了ARA对草鱼生长、血清生化与免疫指标、抗氧化状态、组织脂肪酸组成、脂肪组织脂质代谢、线粒体及凋亡相关基因表达的作用；最后，分析了LNA对草鱼生长、血清生化、抗氧化状态和脂肪酸组成的影响。离体研究方面，分析了草鱼脂肪细胞分化过程中线粒体发育及相关基因表达情况，检测了DHA对草鱼脂肪细胞抗氧化状态、线粒体及凋亡基因表达的影响，探讨了DHA和EPA对草鱼脂肪细胞分化初期线粒体相关基因的表达及成熟脂肪细胞水解及凋亡的影响。此外，为了更好地完成项目目标，增加了组学技术研究HUFA影响草鱼肝胰脏基因表达、日粮HUFA影响草鱼肝胰脏水解关键基因ATGL以及DHA/EPA比率影响草鱼脂肪酸组成及脂质代谢关键酶及基因表达等方面的内容。.研究结果显示，在体饲喂PUFA可抑制草鱼脂质合成代谢基因的表达，促进脂质分解与线粒体相关基因的表达，降低草鱼肝脏和脂肪组织柠檬酸合酶的活力，最终降低鱼体腹腔脂肪组织含量，且可能对草鱼先天性免疫有一定作用。草鱼脂肪细胞分化过程中，线粒体的数量及蛋白含量与其发育相关基因表达均呈现升高趋势。DHA和EPA可抑制脂肪细胞增殖与分化，二者均可促进细胞线粒体发育相关基因的表达，还可促进草鱼成熟脂肪细胞的水解以及水解及凋亡基因的表达。另外，转录组研究发现，HUFA可显著影响草鱼肝脏232个基因的表达，其中包括15个与线粒体作用相关的基因。DHA/EPA比率影响草鱼肝胰脏和脂肪组织的脂肪酸组成及脂质代谢基因的表达。以上研究结果表明， PUFA可通过调控草鱼脂肪细胞线粒体相关基因的表达 影响线粒体发育，调节胞内脂质代谢，降低脂质蓄积，调控脂肪细胞增殖分化及其脂质水解，并对脂肪细胞的凋亡有一定的诱导作用。项目成果对进一步明确PUFA对草鱼脂肪细胞的作用及机制，完善淡水鱼类脂肪酸营养原理，以及从营养饲料学角度解决鱼类脂质代谢紊乱问题提供了研究思路和理论依据。