骨髓间充质干细胞外泌体携带的miR-let-7c对多发性骨髓瘤血管形成影响的研究

Studies have shown that the exosomes are closely related to the angiogenesis of malignant tumors, including multiple myeloma (MM). Its primary efficacy is achieved through the carrying of miRNA. The exosomes were found in the supernatant of MM bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) in our early stage study, macrophages can be polarized by exosomes,and miR-let-7c was detected in the exosomes of BMMSCs. We speculate that miR-let-7c is the cause of macrophages polarization, macrophages can promote MM angiogenesis after polarization. There may be other mechanisms for miR-let-7 to promote MM angiogenesis. Inhibition of miR-let-7c inhibits the formation of MM blood vessels in vivo and in vitro. This project intends to study the mechanism of macrophages polarization induced by miR-let-7c in the BMMSCs exosomes and the effect of polarization on the angiogenesis of MM, and explore its mechanism. Other possible mechanisms of miR-let-7c in MM angiogenesis will be studied. The effects and possible mechanisms of miR-let-7c-inhibitor on macrophages polarization and MM angiogenesis will be observed. It will provide a theoretical basis for further exploring new ways to block the formation of MM angiogenesis.

研究表明外泌体与包括多发性骨髓瘤(MM)在内的恶性肿瘤血管生成密切相关,其主要效能是通过携带的miRNA完成的。我们前期在培养的MM骨髓间充质干细胞(BMMSCs)上清液中发现的外泌体，可使巨噬细胞发生极化，并检测到BMMSCs外泌体中富含miR-let-7c，推测miR-let-7c是引起巨噬细胞极化的原因，极化后巨噬细胞可促进MM血管形成，miR-let-7促进MM血管形成可能还存在其它机制，对miR-let-7c抑制可体内外抑制MM血管形成。本项目拟研究BMMSCs外泌体中miR-let-7c引起巨噬细胞极化的机制及极化后对MM血管新生的影响，并探讨其机制；研究miR-let-7c对MM血管形成的其它可能机制；观察miR-let-7c-inhibitor体内外对巨噬细胞极化及MM血管生成的影响及可能机制。为进一步探讨阻断MM血管形成的新途径提供理论依据。

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种是血液系统常见的恶性肿瘤。其肿瘤血管生成是促进骨髓瘤细胞生存、增殖及迁移的重要因素之一。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）是MM骨髓微环境中最重要的免疫细胞。外泌体可通过多种途径将其内容物运送至靶细胞，进而调控靶细胞的功能。肿瘤细胞源性外泌体具有独立合成miRNA的能力，不同肿瘤细胞分泌的外泌体中包含特殊的miRNA。miR-let-7c在BMMSCs分泌的外泌体中呈现高表达。但目前，关于BMMSCs释放的外泌体在MM中作用以及MM骨髓微环境中miR-let-7c对于血管生成调控机制的研究较少，探讨其机制可为揭示MM的发生发展以及MM的靶向治疗提供新的研究思路。我们从MM患者骨髓组织中分离并原代培养BMMSCs，采用超高速离心及ExoQuick-TC法两种方法提取外泌体并比较其优劣，通过流式细胞仪和qRT-PCR发现外泌体与TAMs共培养组中M2型特异性标志物CD206的水平明显升高，细胞内miR-let-7c的水平上调，并在共聚焦显微镜下观察到PKH26标记的外泌体向TAMs胞浆内聚集。 说明BMMSCs来源的外泌体对TAMs向M2型分化有一定促进作用。接着，我们从MM患者骨髓组织中分离并原代培养MVECs，通过CCK-8试剂盒、划痕实验和Transwell迁移实验以及小管形成实验结果发现，MVECs与M2型TAMs共培养72 h后细胞增殖、迁移及成管能力增加。说明极化为M2型TAMs可以促进MM的血管生成。最后，我们通过生物信息学软件miRDB和Targetscan预测出miR-let-7c与AGO1存在与3′UTR结合的靶向调控区。采用双荧光素酶报告基因实验证明miR-let-7c对AGO1的靶向抑制作用，并发现过表达miR-let-7c后，MVECs稳染株细胞内HIF-1α、VEGF的mRNA及蛋白水平明显增加，AGO1的mRNA及蛋白水平下降，且细胞增殖能力、迁移能力及成管能力明显增加。以上结果均在动物实验中得了进一步验证，故我们认为，BMMSCs 释放的外泌体中miR-let-7c可在体内外诱导MΦs极化为M2型TAMs，通过HIF-1α/Let-7/AGO1/VEGF信号通路，促进MM血管生成，其具有成为MM理想治疗靶点的潜力。