肝脏生物钟通过USP2-45/PPARα信号通路调控肝脏甘油三酯含量的机制研究

The homeostasis of hepatic lipid metabolism is closely related to human health. It has been shown that circadian clock dysfunction of human body can cause fatty liver disease. However, the underlying molecular mechanism remains largely unknown. Our preliminary results showed lower hepatic triglyceride content, higher mRNA expression of deubiquitinase Usp2-45, higher PPARα protein level and its downstream signaling pathways in circadian clock gene Per1/2/3 triple knock out mouse. We hypothesize that hepatic circadian clock regulates the transcription of Usp2-45 mRNA expression, USP2-45 controls the degradation and stability of PPARα by deubiquitination, PPARα thus affects hepatic lipid metabolism. The Per triple knock out mouse, clock gene Bmal1 hepatocyte specific knock out mouse, Usp2 knock mouse are used in this study. We will investigate the hepatic circadian clock control of hepatic lipid metabolism, and uncover molecular mechanism of hepatic circadian clock control of hepatic triglyceride content via USP2-45/PPARα signaling pathway, using Oil Red O staining, RNA-sequencing, Real time-quantitative PCR, Western blot, Immunohistochemistry, Promoter activity analysis, Real time bioluminescence monitoring system, Chromatin immunoprecipitation, and Co-immunoprecipitation techniques. Therefore, this study will provide us theoretical and experimental basis for a comprehensive understanding on regulatory networks of hepatic lipid metabolism, treatment of metabolic diseases such as fatty liver disease by identifying its molecular targets from the point of view of circadian clock.

肝脏脂肪代谢稳态与人类健康密切相关。研究证明人体生物钟调控功能紊乱可导致脂肪肝的产生，但其具体分子机制还不清楚。我们研究发现，钟基因Per1/2/3敲除小鼠肝脏甘油三酯含量显著降低，去泛素化酶Usp2-45表达升高，PPARα蛋白及其下游信号通路上升。本研究以“肝脏生物钟在转录水平调控Usp2-45的表达，USP2-45通过去泛素化调节PPARα蛋白的降解，从而影响肝脏脂肪代谢”为假说，通过Per全身性敲除、肝细胞特异性Bmal1敲除、Usp2敲除小鼠模型，利用油红O染色、转录组测序、RT-qPCR、WB、IHC、启动子活性分析、实时生物荧光测定、ChIP、CoIP等技术，研究肝脏生物钟对肝脏脂肪代谢的影响，并揭示肝脏生物钟通过USP2-45/PPARα信号通路调控甘油三酯含量的分子机制。为全面认识肝脏脂肪代谢调控网络，从生物钟角度寻找治疗脂肪肝等代谢性疾病的靶位点提供理论基础和实验依据。

肝脏脂质代谢稳态与人体健康密切相关。已有证据表明，生物节律紊乱可导致脂肪肝等多种代谢病的发生，但其具体的分子机制尚不明确。本项目围绕“肝脏生物钟在转录水平调控Usp2-45的节律性表达，USP2-45通过去泛素化调节PPARα蛋白的降解，从而影响肝脏脂质代谢”的科学假说，利用Per1/Per2/Per3敲除（Per null）、Bmal1全身性敲除（Bmal1-/-）和Bmal1肝脏特异性敲除（L-Bmal1-/-）小鼠模型，开展了一系列研究工作。研究发现，与对照组相比，Per null小鼠肝脏甘油三酯含量呈现显著下降的趋势，并失去昼夜节律性变化。蛋白质免疫印迹结果显示，Per null小鼠肝脏中PPARα蛋白表达量显著上升，且其下游靶蛋白CYP4A10表达显著上调。与野生型（WT）小鼠相比，Usp2-45 mRNA的表达在Bmal1-/-与L-Bmal1-/-小鼠肝脏中的表达均显著降低且失去节律性变化，而Usp2-69的表达量差异不显著。双荧光素酶报告实验表明，生物钟核心蛋白BMAL1/CLOCK通过可变启动子选择性调控Usp2-45的节律性表达，而对Usp2-69无明显调控作用。EMSA实验结果表明，BMAL1蛋白与Usp2-45 启动子区域53 bp的碱基序列存在结合活性。进一步研究发现，BMAL1/CLOCK通过作用于Usp2-45启动子区域的4个非典型E’-box序列调控其节律性转录。本项目解析了肝脏生物钟调控Usp2-45节律性转录的分子机制，证实了生物钟调控肝脏脂质代谢的重要作用，为从生物钟角度寻找治疗脂肪肝等代谢性疾病的靶位点提供了前期基础和新思路。然而，USP2-45去泛素化调节PPARα降解的作用机制尚待进一步的深入研究。本项目计划发表研究论文5篇以上，截止目前项目负责人以第一作者或通讯作者发表基金标注论文16篇，其中SCI收录论文9篇，北大核心期刊收录论文7篇，培养硕士生2名，协助培养博士后1名。