结核分枝杆菌双因子信号转导系统MprAB对ESX-1毒素蛋白分泌系统的调控机理研究

结核分枝杆菌的ESX-1分泌系统负责将毒素蛋白从菌体内传递到宿主细胞中，对结核菌的毒力至关重要。初步研究发现双因子系统MprAB的调节蛋白MprA可以结合在ESX-1分泌系统的关键基因Rv3616c的启动子上，而且在mprAB突变菌中Rv3616c的表达呈上调趋势，预示MprAB系统对ESX-1分泌系统具有负调控作用。本项目以此为基础，首先构建Rv3616c启动子与LacZ和GFP的融合质粒，通过检测报告基因的表达水平，阐明MprAB系统在体外对Rv3616c表达的调控；其次以不同的胁迫条件处理结核菌，分析不同条件下Rv3616c的诱导表达；然后通过凝胶迁移和DNA酶足迹分析定位MprA结合的Rv3616c启动子核心序列，阐明MprAB调控Rv3616c的机制；最后提取H37Rv和mprAB突变菌的分泌蛋白，通过蛋白杂交技术检查ESAT-6的含量，阐明MprAB对ESX-1系统功能的调控。

经过三年的工作，我们顺利完成了预订的各项研究计划，取得了以下主要研究成果：.1，发现了结核菌的一个新的ESX-1蛋白分泌系统的调控因子。在启动本研究之前，文献已报道了两个ESX-1分泌系统的调控因子，分别是PhoP和EspR。本研究阐明了MprAB是ESX-1蛋白分泌系统的第三个调控因子。.2，揭示了MprAB对 Rv3616c操纵子的负调控作用。PhoP和EspR都通过调控Rv3616c的表达影响ESX-1系统的分泌功能。在PhoP和EspR的突变菌中，Rv3616的转录下降，因此PhoPR和EspR对Rv3616c的调控是一种正调控作用。基因表达分析显示Rv3616c和同一操纵子中的基因Rv3614c在MprAB突变菌D981中的表达显著高于在野生型菌株H37Rv和互补菌株中的表达水平，说明MprAB负调控Rv3616c操纵子的转录，不同于PhoPR和EspR对Rv3616c操纵子的正调控。.3，发现了Rv3616c启动子序列上的多个MprA结合位点。由于EspR能直接结合Rv3616c启动子调控Rv3616c的表达，以及MprA对Rv3616c的调控作用，促使我们利用电泳迁移分析检测MprA能否结合Rv3616c启动子。我们的研究表明MprA能够结合在Rv3616c-Rv3617c基因间隔区的不同区域。结合对DNA序列的突变，我们鉴定了三个有效的MprA结合位点，从而解释了为什么MprA可以结合Rv3616c启动子。.4，明确了MprAB对ESX-1分泌系统功能的影响。在PhoPR和EspR的突变菌中，ESX-1系统的功能受到抑制，在上清液中几乎检测不到ESAT-6。为了解MprAB对ESX-1功能的影响，我们检测了在D981提取物中ESX-1底物蛋白的水平，发现在D981中，ESAT-6，EspA和EspB的水平显著低于其在野生型菌株和互补菌株中的水平，说明MprAB调控ESX-1分泌系统的功能。.5，阐明了MprAB对宿主细胞免疫响应的影响。ESAT-6是ESX-1系统最重要的底物蛋白，同时也是结核菌的主要毒力因子之一，可以诱导促炎症细胞因子的分泌，在宿主与病原菌的相互作用中具有非常重要的作用。与野生型H37Rv感染的细胞相比，D981感染的巨噬细胞只能产生低水平的白细胞介素IL-1β和肿瘤坏死因子TNF-α，表明MprAB能够影响宿主的免疫响应