基于NF-κB/iNOS/NO信号通路探讨中药复方玉女煎改善胰岛炎症微环境的分子机制

The compound Yunvjian has a good clinical effect in treatment of diabetes, but the mechanism is unclear. Our previous data demonstrated that Yunvjian decreased effectively the production of NO in pancreatic β cell INS-1. We speculate that Yu Nvjian exerts anti-diabetic effect by regulating the pancreatic inflammation environment, and NF-κB/iNOS/NO pathway maybe involved in the process. This project intends to study the effect and mechanism of Yunvjian on the pancreatic islet inflammation in type 2 diabetes mellitus. In vivo, we will investigate the influence of Yunvjian on the pancreatic islet inflammation of rat with type 2 diabetes by Western blot, Gel shift assay and ELISA. In vitro, firstly, we will study the protective effect of Yunvjian on the inflammation in INS-1 cell induced by IL-1β and IFN-γ by Dark-field imaging and Flow cytometry. Secondly, the mechanism of Yunvjian regulating the β-cell inflammation will be investigated by Western blot, Immunohistochemistry and Luciferase reporter system based on NF-κB/iNOS/NO pathway. This project will provide new insights into the mechanism of Yunvjian treating type 2 diabetes mellitus.

玉女煎用于治疗2型糖尿病有显著的临床效果，但其作用机制尚未明确。我们前期研究结果显示，玉女煎能有效地抑制IL-1β和IFN-γ联合诱导的INS-1胰岛瘤细胞生成NO，保护胰岛细胞。我们推测玉女煎可能通过调节胰岛炎症微环境发挥抗糖尿病作用，该作用可能与NF-κB/iNOS/NO信号通路密切相关。本项目拟首先从动物水平通过Western blot和凝胶阻滞电泳评价玉女煎对胰岛炎症的影响；随后从细胞水平通过细胞暗场成像技术、流式细胞技术等评价玉女煎对IL-1β和IFN-γ联合诱导的胰岛β细胞形态、凋亡及胰岛素分泌功能的影响；再通过Western blot技术、免疫荧光技术及荧光素酶报告系统基于NF-κB/iNOS/NO信号通路对玉女煎干预胰岛炎症的作用机制进行深入地探讨。本课题将从新的视角阐明玉女煎干预2型糖尿病的机制，为炎症反应途径作为2型糖尿病治疗的靶点提供新的实验和理论依据。

本课题以玉女煎为研究对象，通过动物、细胞和分子水平对玉女煎的抗糖尿作用及机制进行了探讨。首先在动物水平，利用高脂饮食联合链脲佐菌素诱导大鼠2型糖尿病模型，通过检测空腹血糖、空腹胰岛素、血清血脂生化指标及胰岛组织形态及NF-κB信号通路关键蛋白表达，评价玉女煎的抗糖尿病作用。结果显示，玉女煎能显著降低糖尿病大鼠血糖水平，改善葡萄糖耐受性及胰岛素敏感性，降低大鼠血清中TG、TC及LDL水平，升高HDL水平，同时显著降低血清中IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子水平，提高抗炎因子IL-2水平。H&E染色结果显示，玉女煎能显著保护胰岛组织，改善胰岛组织形态；Western blot结果显示，玉女煎能显著抑制糖尿病大鼠胰岛组织中NF-κB炎症信号通路活性，抑制NF-κB的表达及IκBα的降解。在细胞水平，本课题建立了IL-1β联合IFN-γ诱导INS-1炎性损伤模型，通过MTT实验、GSIS实验、免疫荧光染色、流式细胞术及Western blot探讨玉女煎保护胰岛炎性损伤的分子机制。结果显示，玉女煎能以浓度依赖的方式保护炎症因子诱导的胰岛细胞损伤，提高INS-1细胞存活率，抑制NO分泌，抑制iNOS及COX-2 mRNA及蛋白的表达，改善细胞胰岛素分泌能力。Western blot结果显示，玉女煎能显著抑制炎症因子诱导的NF-κB信号通路活性，抑制NF-κB表达和IKBα磷酸化，该结果进一步通过荧光素酶报告系统和加入NF-κB抑制剂L-NAAM得到验证。随后，本课题还进一步对玉女煎及其主要成分芒果苷的抗炎活性及机制进行了研究。结果显示，玉女煎及芒果苷均能通过抑制NF-κB信号通路活性干预LPS诱导的小胶质细胞及RAW264.7细胞炎症。综上研究证实，玉女煎能显著改善2型糖尿病，且其作用机制与NF-κB/iNOS/NO炎症信号通路密切相关。