脂滴在miRNA的贮存（运输）/装配中的作用研究

Lipid droplet (LD) is a subcellular multi-functional organelle. LDs are surrounded by a protein-coated phospholipid monolayer with a hydrophobic neutral lipid core, and confer many important roles in multiple biological processes. An imbalance between large and small LDs may be a central event in the development of metabolic syndrome. microRNAs (miRNAs) , a class of small noncoding RNAs, typically 22 nucleotides in length, are distributed in distinct intracellular locations. Dysregulation of miRNAs can lead to a multitude of metabolic disorders. Here we will focus on the lipid droplet-involved miRNA storage (transport) and loading. We will commence study from the lipid droplet subpopulations by size as an entry point. The miRNA expressions on the purified LD subpopulations will be determined. Meanwhile, the miRNA-binding proteins on lipid droplet will be identified. Artificial lipid droplets will be used to learn how LDs will influence miRNA. And we will modify miRNA binding to lipid droplets by mutated the miRNA-binding proteins and study how the function of miRNA will be influenced. Further, how the miRNA and its complex are assembled on lipid droplets and how the miRNA is loading will be studied to find out the role of LD in miRNA storage or loading. To date, we have set up the way to separate lipid droplets by size as well as the artifical lipid droplet system. Various miRNAs have been identified on hepatic lipid droplet. The miRNA-binding protein AGO2 has been found to locate on isolated lipid droplets and it exhibited different locations on distinct LD subpopulations.

脂滴是一种单层磷脂膜包裹中性脂，表面分布多种蛋白的多功能细胞器。细胞中大小脂滴数量的“失衡”，可能是诱发代谢疾病的主要原因。miRNA，约22个核苷酸的非编码小分子RNA，在细胞内的定位呈多样性。miRNA调控的异常，往往与代谢性疾病的发生相关。本项目将就脂滴在miRNA的贮存及装配过程中的作用开展研究。我们将纯化大小不同的脂滴，检测（目标）miRNA表达（谱），确定大小不同脂滴上的miRNA结合蛋白。以人工脂滴为工具，构建miRNA结合蛋白突变体以改变miRNA结合脂滴的能力，分析脂滴对miRNA结合及活性的影响，进一步探索miRNA及其复合物在脂滴上的存在形式，并由此确定脂滴在miRNA贮存或是装配中的作用。前期已建立大小脂滴分离方法、构建了人工脂滴。在肝细胞脂滴上发现了多种miRNA及miRNA结合蛋白AGO2，而AGO2在大小脂滴上定位不同。这为我们将要进行的研究奠定了坚实的基础。

脂滴是一种单层磷脂膜包裹中性脂，表面分布多种蛋白的多功能细胞器。脂滴最开始只被认为是“惰性的”中性脂贮存场所，近20年研究表明脂滴参与许多重要的生物学过程。细胞中大小脂滴数量的“失衡”，可能是诱发代谢疾病的主要原因。因此，揭示脂滴动态变化的调控机制意义重大。miRNA是约22个核苷酸的非编码小分子RNA，在细胞内呈多样性的定位。研究表明胞浆中miRNA调控的异常，往往与代谢性疾病的发生相关。但是，miRNA与脂滴之间的关系目前尚未报道。此外，现在已知被认为具有编码蛋白的能力，仅占人类基因组约1.5%。测序技术及生物信息方法的高速发展，揭示了许多过去被注释为非编码的RNA，可能具有编码蛋白的能力。事实上，目前已发现了数十个蛋白是由过去被认为不翻译的基因编码，这些蛋白定位于多个不同的细胞器，在多个生物学过程中发挥着重要的作用。而脂滴上是否存在由非编码RNA编码的蛋白仍然未知。本课题首次开展了脂滴上miRNA可能的结合蛋白的鉴定工作，发现AGO2，DDX3X可能参与HCV Replicon Huh 7.5.1中，miRNA在脂滴上的募集。此外，建立崭新的脂滴蛋白质组研究模式，从非编码RNA入手，利用一种崭新的蛋白质组研究思路，在骨骼肌细胞脂滴上鉴定到一些全新的脂滴蛋白，这些蛋白由过去被认为是由非编码RNA的序列翻译，并能够调控脂滴的形态，影响骨骼肌细胞甘油三酯的贮存及胰岛素灵敏性。此外，以肝脏脂滴和线粒体蛋白的变化为切入点，研究了肝脏在不同环境温度中糖脂代谢的变化，并发现了参与脂滴动态变化的可能蛋白及机制。这些方法的建立和结果的取得，为脂滴动态变化调控的研究，进而探索脂滴在人类代谢性疾病方面中的角色，提供了崭新的思路及线索。