细胞外核复合体在糖尿病肾病进展中的作用

We have reported that increased phosphatidylserine (PS) exposure enhanced prcoagulant activity in nephrotic syndrome (Thromb Haemost 2012) . PS and neutrophil extracellular DNA traps (NETs) induced thrombosis coordinately (Thromb Haemost 2015). The aim of this study is to evaluate the association of neutrophil extracellular DNA traps (NETs) released by neutrophils and the progress of diabetic kidney disease (DKD). The process of neutrophil death (NETosis) is vividly traced on releasing NETs and the role of NETs on endothelial cells and podocytes of glomerulus are elucidated; because NETs/PS provide binding sites for clot factors, we dynamically monitored the association of NETs/PS and fibrin deposit in real time and observed the relationship between NETs and thrombus through fluorescent staining in situ; Renal dysfunction and pathological changes are determined, relevance among NETs, coagulation/inflammation and renal damage are analysed at the same time. Additionally, to identify the new targets on coagulation or inflammatory pathway, we use DNase and antibodies against histone to block NETs, achieving the benefits of interdisciplinary subjects; This study contributes to revealing the important role of NETs in DKD progression and establishing new therapeutic approaches for the treatment of DKD.

我们报道了肾病综合征磷脂酰丝氨酸(PS)外翻致促凝(Thromb Haemost 2012),PS与中性粒细胞细胞外核复合体(NETs)共同作用影响疾病血栓生成(Thromb Haemost 2015)。本项目以糖尿病肾病(DKD)中性粒细胞为对象, 研究其释放的NETs与DKD疾病进展的关系。阐明中性粒细胞死亡(NETosis)释放NETs的机制及NETs对肾小球内皮细胞和足细胞的损伤;NETs为凝血因子提供支架,PS提供催化表面, 原位、实时、动态监测NETs/PS与纤维蛋白沉积的关系及原位染色观察NETs与DKD血栓形成的关系;检测肾脏功能失调及病理改变,分析NETs,凝血/炎症,及肾脏损伤之间的关系;同时利用DNase/组蛋白抗体阻断NETs,明确其参与凝血及炎症途径的新靶点;实现由多学科交叉。从细胞和分子信号转导水平揭示NETs在疾病进展中的重要作用并为DKD治疗提供新靶点。

大量研究表明高糖，缺氧及病原体刺激下，中性粒细胞（PMN）活化，能够释放中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)结构，后者已证实在糖尿病，糖尿病视网膜疾病、慢性肾脏病等疾病中发挥促凝作用。高糖环境下PMN活化产生的NETs可激活内、外源性凝血途径，促进血小板粘附与聚集，参与血栓形成，激活活性氧发挥纤溶抵抗作用，加重肾小球硬化及肾脏的纤维化。糖尿病肾病（DKD）早期肾脏病理表现为基底膜增厚及小动脉玻璃样变，引起小动脉粥样硬化，增加动静脉血栓的形成，但对于其高凝及血栓形成途径并没有很好地解释。本项目以NETs为切入点，通过炎症血栓这一桥梁解释糖尿病肾病患者高凝状态原因，同时认为NETs也加剧肾纤维化的发生，且证明了在这一途径中，除了胞外诱捕网结构，被激活的各种促凝血细胞微粒数量增加，且表面磷脂酰丝氨酸（PS）的暴露参与凝血的发生。相关结论如下：（1）DKD患者外周血微粒数量较正常人升高，且随着疾病严重程度升高更明显，主要来源于红细胞、内皮、血小板、中性粒细胞等，这些细胞来源的微粒表面暴露的PS激活内外源性凝血途径，促进纤维蛋白原沉积；（2）DKD患者高糖、高尿酸环境促进血细胞微粒生成，表面PS表达；（3）乳黏素能够对PS进行标记，且比Annexin V更敏感；（4）DKD组与健康对照组相比NETs水平明显增多，大量蛋白尿组患者血浆中NETs水平高于微量蛋白尿组；（5）体外DKD血浆、5mmol/L 、25mmol/L葡萄糖溶液分别可激活PMN释放NETs，2.5mmol/L低糖溶液不能激活PMN产生NETs；（6）与对照组相比，DKD组凝血时间明显缩短，纤维蛋白及凝血酶复合物生成明显增加；DNase抑制NETs后，凝血时间明显延长，纤维蛋白及凝血酶复合物生成明显减少；（7）NETs刺激下内皮细胞活化比例增加，细胞收缩，细胞间紧密连接消失，纤维蛋白微丝明显表达。DNA酶及抗组织因子降低内皮细胞的活化水平。本研究为DKD高凝形成的治疗提供新的靶点，进一步研究了肾小球硬化的病因，为DKD的诊断治疗提供理论依据。