里氏木霉内切葡聚糖酶EGI催化纤维素水解的机理研究

Trichoderma reesei cellulase catalyzed hydrolysis of cellulose has gained great attention in the field of industry and academia due to its low energy consumption, mild reaction conditions and less contamination. Its catalytic process has been actively studied. However, the catalytic mechanism in molecular level is not very clear. In this project we will combine the computer modeling and the molecular biology experiment to investigate the adsorption of Trichoderma reesei EGI on cellulose surface and the processive movement of the enzyme. We will use molecular dynamics simulations to identify the important amino acid residues and fragments which will then be characterized by mutagenesis approaches to evaluate the impact on enzyme adsorption, processivity and activity against various substrates. The combined study will help to elucidate the catalytic mechanism and provide vital information to potentially improve the catalytic efficiency through protein engineering. The method adopted in our work will also offer hints to other studies of the enzyme catalysis in the solid-liquid mixing phase.

里氏木霉纤维素酶水解纤维素具有能耗低、反应条件温和、污染少等优点，受到学术界、工业界的极大关注。其催化过程一直是研究热点，但是在分子层面酶与底物作用模式、催化水解机理并不清晰。本项目将以里氏木霉内切葡聚糖酶EGI为研究对象，采用理论模拟与酶学实验相结合的方法，对内切葡聚糖酶EGI在纤维素表面上的吸附和滑移过程进行研究。利用分子动力学模拟探索在此过程中起重要作用的氨基酸残基和区域。通过突变体构建、表达和纯化，对各突变体在纤维素表面吸附和滑移、对不同底物活性进行表征。考察关键氨基酸对酶催化反应机制的影响，并阐明其反应机理，为提高酶活性的蛋白质工程研究提供有用信息。同时本项目的成功实施也将为其它固液两相酶催化反应的研究提供参考。

里氏木霉纤维素酶是目前研究最为广泛的纤维素酶体系之一。本项目主要以内切葡聚糖酶EGI为研究体系，试图通过不同角度（pH、温度稳定性、催化活性、吸附能力和滑移能力）改造该酶，使EGI具有更好的应用前景。主要研究结果和成果如下：.（1）我们通过计算机模拟设计突变体来优化酶与寡糖过渡态的作用力从而降低活化能，并采用酶催化动力学方法测量了最优突变体对催化效率的影响。采用该方法，我们最终获得了3个活性显著提高的突变体，使得EGI-CD的催化活性提高了50%左右。.（2）我们在EGI-CD活性位点周围开展了理论计算和酶催化动力学研究。结果表明活性位点周围较多的水分子存在，导致了活性位点区域的介电常数较大，解析了静电作用对于酶催化的影响机制，并能够使酶的反应pH发生定向的改变。.（3）我们应用计算模拟方法构建了EGI-CD与纤维素表面吸附模型，确定了在吸附过程中起主要作用的氨基酸残基及区域。结果表明，EGI-CD的吸附能力变化对EGI-CD的活性影响较小，酶对不溶纤维素底物的活性与酶的剪切能力成正相关，且酶的催化速率越大越容易导致在水解纤维素过程中发生阻塞的情况。.（4）我们应用计算模拟方法构建了EGI-CD与纤维素表面滑移模型，确定了EGI-CD在滑移过程中起主要作用的氨基酸残基及区域。结果我们发现滑移能力大小的实验值与理论计算值拟合的非常好，酶的催化活性与滑移能力呈负相关的关系。.（5）我们还发展了一种基于蛋白质热点区域搜索的计算方法，并通过设计二硫键增强蛋白质作用力来提高蛋白质的稳定性。最终我们获得的组合突变体的T50比野生型提高了11.0℃，对底物滤纸和结晶纤维素的活性分别提高了18%和23%。.（6）本项目的实施使EGI-CD在应用过程中具有更好的稳定性和催化活性，提高了该酶的应用价值，且我们开展的研究方法和思路为其他酶制剂的研究提供了宝贵的经验和借鉴作用。本项目总共发表SCI论文4篇, 在生物工程和生物技术重要期刊Biotechnol. Bioeng.发表论文2篇，申请发明专利1项。