有效供液促进里氏木霉固态发酵高产纤维素酶的机理研究

Achievement of controllable substrate moisture is crucial for large-scale solid-state fermentation (SSF). Regrettably, the existing empirical water supply methods could not support the modern SSF industry. Thus, it is crucial for theoretical study on the stimulation mechanisms of moisture controlling strategies before scaling up this technique. In this project, enhanced cellulase production by Trichoderma reesei on maize straw under solid-state fermentation is obtained by available water supply. The stimulation mechanisms will be analyzed from three levels of matrix, microbiology and fermentation system, respectively. Additional results include the followings: 1) The measure methods for matrix water characteristics, kinetics and thermodynamics parameters will be established from the view of physics; 2) The microbial response mechanism to available water supply will be explained at physiological and molecular levels; 3) An appropriate mass and heat transfer model for the water supply SSF will be constructed on the thought of “segmented mosaic”. This study will reveal the stimulation mechanisms of available water supply on SSF, achieve rational construction of mass and heat transfer model for SSF which will provide a guide to scaling up of water supply mode, and eventually accelerate the industrialization and controllability of modern SSF efficiently.

基质水分可控化是实现固态发酵规模化的关键技术。然而现有经验供液方式研究无法满足日益发展的固态发酵工业化需求，需要从原理上揭示供液调控机理，指导供液方式的固态发酵放大研究。本项目旨在基于构建的固态发酵有效供液技术，分别从基质、微生物及发酵体系三个层次深入解析基质有效供液促进麦秸固态发酵制备纤维素酶的作用机理。项目将建立基质物性参数表征体系，解析微生物在生理水平与分子水平上对供液调控的响应机制，并构建基于“分段拼接”方法的基质供液传质传热模型。本项目的实施将揭示基质供液促进固态发酵作用机理并实现其质热传递模型的理性构建，有效指导固态发酵供液方式放大研究，加快固态发酵工业化与可控化进程。

水分在固态发酵中发挥重要作用，然而微生物利用和水分蒸发，使水分逐渐减少，影响固态发酵。因此固态发酵中水分在线监测与调控十分重要。通过低场核磁共振技术构建发酵基质水分检测方法，并通过保水剂供液方式，研究供液促固态发酵作用。取得以下结果：. (1) 构建木质纤维素类基质物性参数与水分参数的表征方法。如采用环刀法测容重；气体吸附法测比表面积；差示扫描量热法测比热容；低场核磁共振技术测不同能态水分含量。发现固态发酵中，基质水主要以毛管水形式存在，且发酵中主要的散失水也是毛管水。吸附水驰豫峰面积变化不大，但占基质水分比例增加。同时发酵基质的横向驰豫时间在逐渐减小，说明基质与水分间作用力增加。.(2) 添加保水剂实现基质毛细管水的在线供液，最佳添加量为7.5 g饱和保水剂/24.93 g湿基质 (含水量70%)，Trichoderma reesei RUT C30的FPA和CMC分别达到376.840 U/g和1025.968 U/g，比对照组提高了2.327倍和1.646倍。低场核磁共振扫描发现，基质水分驰豫峰面积逐渐减小，说明发酵基质水分逐渐减少，但供液固态发酵驰豫峰面积大于静置固态发酵，说明保水剂的添加可以有效实现基质供液。供液固态发酵基质主峰保留时间低于静置固态发酵，表明基质物理结构改变。比较基质物性参数，发现供液固态发酵基质的表面积、孔隙度和比热容的最大值都高于对照固态发酵，分别提高15.14%、1.66%和16.74%，说明供液固态发酵更有利于发酵基质的传质、传热和微生物生长。.(3) 利用RNA-Seq研究T. reesei固态发酵过程中的基因表达谱，与对照相比：早期发酵阶段，氮代谢和维生素B代谢相关差异表达基因上调，FPKM表达量差异可达35.13和4.22倍；中期发酵阶段，水解纤维素相关反应基因上调，FPKM表达量差异可达4.06倍，核糖体生物合成基因下调；后期发酵阶段，核糖体生物合成基因下调。对供液固态发酵转录组的动态分析揭示：从早期到中期，氨基酸代谢和碳水化合物代谢相关基因转录水平上调，对应生物的生长阶段更活跃以及水解反应更活跃。这些发现在分子生物学水平上揭示了里氏木霉供液固态发酵产纤维素酶过程。