DNA腺嘌呤甲基化修饰调节恶性疟原虫致病因子表达的机理研究

Malaria is one of the most serious infectious diseases all over the world, and Plasmodium falciparum is considered the most serious pathogenic. P. falciparum mainly through the 60 var gene members encoded antigen variant protein (PfEMP1) to form a mutually exclusive expression strategy to escape human host immune system protection. Until now, it is not clear that the key regulatory factors regulating var gene family transcription and their mechanism are unclear. Combined with our early study, through our independently developed P. falciparum CRISPR/dCas9 epigenetic editing system, we firstly identified a DNA adenine N6-methytransferase（PfNAMT）, the transcription inhibition of the PfNAMT leading to the silence expression of all var gene members. In order to explore the molecular mechanism of PfNAMT and DNA 6mA modification involved in regulating the mutually exclusive expression of virulence genes, this project intends to carry out the following research: ① Elucidation of PfNAMT-mediated 6mA modification in regulating the transcription expression of different var gene and the epigenetic molecular mechanism; ② Identification the biochemical characteristics and molecular mechanisms of other key regulatory factors that jointly regulate the transcription of var gene with PfNAMT. These studies will improve the revealing the mechanisms of Plasmodium parasites escape human immune protection system, and will also provide new insights for the research and development of malaria treatment drugs.

由疟原虫感染引起的疟疾是全球范围内三大传染性疾病之一，严重威胁人类生命健康。致病性最高的恶性疟原虫主要通过60个var基因成员编码的抗原变异蛋白—PfEMP1形成的相互排斥性的表达策略，使人体免疫系统无法有效地清除恶性疟原虫感染。目前，调节var基因家族转录的关键性调节因子及其作用机制尚不明确。在申请人前期研究中，通过前期自主研发的恶性疟原虫CRISPR/dCas9表观遗传编辑系统，首次鉴定出恶性疟原虫DNA 6mA甲基转移酶PfNAMT，PfNAMT的转录抑制导致var基因的沉默表达。在此基础上本项目拟开展如下研究：① 解析PfNAMT介导的6mA修饰调节不同var基因转录的作用方式及表观遗传分子机制；② 阐明与PfNAMT共同调控var基因转录的其他关键调控因子的生化特征及其作用机理。本研究将对恶性疟原虫逃逸宿主免疫监视机理研究以及疟疾治疗药物的研发提供新的借鉴。

由疟原虫感染引起的疟疾仍是三大传染性疾病之一，严重威胁人类健康和生命安全；其中恶性疟原虫是致死性最高、最为严重的疟疾寄生虫。目前，全球范围内均已出现了对一线抗疟药青蒿素耐药性的寄生虫；加上目前仍缺乏有效预防和治疗疟疾感染的抗体和疫苗，因此，近几年疟疾感染的死亡人数并没有出现下降反而有所上升。显然，阐明恶性疟原虫关键致病因子表达的调控规律将为抗疟药和疟疾疫苗的研发提供新的靶标。恶性疟原虫的核心致病因子PfEMP1蛋白是由60个var基因成员编码的抗原家族，形成了相互排斥性的表达策略，使人体免疫系统无法有效地清除恶性疟原虫感染。本项目的主要研究内容是系统阐明DNA 6mA修饰调节恶性疟原虫致病因子表达的机理研究。申请人通过前期自主研发的恶性疟原虫CRISPR/dCas9表观遗传编辑系统，首次鉴定出恶性疟原虫6mA甲基转移酶PfNAMT，获得PfNAMT转录抑制导致var基因的沉默表达的基因修饰虫株PfNAMT-KD，初步解析PfNAMT催化6mA修饰的作用特异性及其调控var基因转录的作用机理及表观遗传分子机制；发现了疟原虫无性期动态分布的6mA修饰具有基因转录调控功能且6mA含量与RNA表达水平存在明显正相关；进一步通过全球7000多个疟原虫基因组测序数据系统分析发现，6mA 修饰与疟原虫基因组进化与突变关系密切，其中以变异程度最高的var基因家族最为显著。在此基础上，针对疟原虫耐药性日益严重的问题，我们对中缅边境近十年内的四百多例人疟样本（包括恶性疟原虫和间日疟原虫）的重要耐药基因进行了突变分析，发现了新的突变趋势以及新的一线青蒿素耐药基因Pfk13新的突变位点，为疟疾病人的临床给药治疗提供重要依据。综上，本项目开展的研究利用原创表观遗传基因编辑技术初步阐明了6mA修饰对恶性疟原虫var基因的表观遗传调控规律和系统总结了疟原虫耐药性的突变趋势。本项目的研究在寄生虫病原生物学和单细胞真核生物表观遗传学研究领域均取得了一系列重要突破，为恶性疟原虫核心致病因子的调控机制研究、临床疟疾的给药治疗和新型药物的研发提供新的借鉴。