水稻发育胚乳中控制谷蛋白ER-Golgi运输关键基因OsGot1的功能研究

Protein is the second-largest component in rice in addition to starch. The content and composition of protein affects rice quality directly. Glutelins are the major storage protein in rice. Therefore, dissection of the biosynthesis, transport, and accumulation of glutelins is of useful for rice protein quality improvement. Our previous studies have identified several key factors involved in glutelin trafficking and accumulation process, including OsVPE1, which plays an essential role in the maturation of glutelin, GPA1/OsRab5a, GAP2/OsVPS9a, and GPA3/OsKelch1, which control post-Golgi trafficking of glutelins. Recently, using two allelic glutelin precursor accumulation mutants, we isolated a novel key factor involved in controlling the anterograde transport of glutelins between ER and Golgi apparatus. This project will try to elucidate the molecular mechanisms of OsGot1 in regulation of the ER-Golgi anterograde transport, which will lay a foundation for elucidating the glutelin trafficking pathway. And in turn provides theoretical directions for further protein quality improvement in rice.

蛋白质是稻米中仅次于淀粉的第二大物质，其含量和组成直接影响稻米的品质。谷蛋白是稻米中最主要的储藏蛋白，因此，对谷蛋白合成、转运和积累的研究将有助于稻米蛋白品质的改良。前期研究中我们利用筛选到的谷蛋白前体增加突变体，已经克隆获得了控制谷蛋白成熟的关键基因OsVPE1，控制谷蛋白后Golgi体运输关键基因GPA1/OsRab5a、GAP2/OsVPS9a和GPA3/OsKelch1，并对它们的功能进行了部分阐述。最近，我们利用两个等位的新谷蛋白前体增加突变体克隆获得了控制谷蛋白ER-Golgi体正向运输关键基因GPA4/OsGot1。本项目拟通过对OsGot1的功能研究，基本明晰OsGot1调控谷蛋白ER-Golgi正向运输的分子机制，为最终阐明谷蛋白合成、转运和积累的网络途径奠定基础，也为稻米蛋白品质的改良提供可靠的理论支撑。

COPII包被膜泡介导真核生物中新合成蛋白从内质网ER向其他内膜区室正向运输的第一步。一组进化上保守的蛋白（Sar1, Sec23, Sec24, Sec13 和Sec31）构成了最基本的COPII膜泡；虽然人们对COPII的组装已经了解相对比较清楚，但目前对COPII组装的调控仍然知之甚少。本研究报道了一个水稻蛋白转运缺陷突变体gpa4，该突变体积累谷蛋白57-kDa前体，并在发育胚乳细胞中形成两种ER衍生的非正常结构，第一个结构中间为谷蛋白，四周为醇溶蛋白包裹；第二种结构呈串珠状，可能为未发育成熟的PBI。对突变体的表型鉴定发现突变体发育胚乳中谷蛋白的ER输出存在缺陷，导致蛋白在ER中大量滞留，从而导致严重的ER胁迫。构建GPA4/N22 F2群体，采用图位克隆的策略获得GPA4基因。在gpa4-1中，突变基因的基因组序列缺失了108bp，导致蛋白只正确翻译了前10个氨基酸，因此gpa4-1是一个功能丧失突变体。GPA4编码一个仅140个氨基酸、进化上保守的的膜蛋白GOT1B，该蛋白与酵母Got1p同源。GOT1B具有四个跨膜区，蛋白酶酶解实验表明其N端和C端均在胞浆中。GOT1B与拟南芥AtSar1b共定位于与高尔基体相连的内质网输出位点ERESs（ER exit sites）。同时，GOT1B与Sec23c互作，且两个蛋白与Sar1b存在于一个复合体中。GOT1B的突变显著改变了Sar1在内膜系统的分布、其与Sec23c的结合及ERES的组织形态，同时我们的研究还发现这种互作在真核生物中高度保守，利用酵母Got1p能够互补gpa4-2的突变表型。综上所述，我们的研究显示了GOT1B在ERES处对COPII的形成起着重要的作用，从而有助于植物细胞中分泌蛋白的正向运输。