AHL结构特异性核酸适配子的筛选及其抗革兰阴性耐药菌感染的研究

针对当前革兰阴性耐药细菌感染不断增加和缺少有效抗生素的局面，本课题将通过干扰细菌群体效应（Quorum sensing，QS）系统的途径抑制细菌毒力，这将在不引发细菌耐药问题的前提下，治疗革兰阴性菌感染。革兰阴性菌QS系统的酰化高丝氨酸内酯（acyl-homoserine lactone, AHL）类信号分子具有相同的AHL结构，仅侧链的长度和氧化还原状态不同。本课题组在通过SELEX技术，获得数个侧链特异性核酸适配子的基础上，将继续采用该技术获得AHL结构特异性适配子，然后进行体外实验，利用适配子结合并清除多种AHL类分子，干扰QS系统，抑制细菌的毒力；再建立细菌感染的动物模型，并用适配子治疗多种革兰阴性菌的感染；最终获得具有广谱抗革兰阴性菌感染效果的适配子。本课题将不仅对细菌毒力与其致病性的关系进行深入的研究，而且研究得到的核酸适配子可作为候选新型候抗菌药物，具有较大的实际应用价值。

我们按照项目计划书的要求，完成了该项目的研究。由该项目资助申请专利2项并发表SCI论文2篇，并取得了预期的成果。.革兰阴性菌群体效应系统（quorum sensing，QS）的信号分子为酰基高丝氨酸内酯（N-acyl homosering lactones，AHL），包括OdDHL和BHL等多种分子，这些分子拥有相同的内酯环，仅侧链的长度和氧化还原状态不同。我们首先合成了末端带有羧基的AHL的类似物：7-oxo-7-[[(3S)-2-oxo-3-pyrrolidinyl] amino]-Heptanoic acid（OdDHLS），这是一种内酯环中的O被N代替的AHL分子类似物。HPLC-MS的检测结果表明，该分子在多种缓冲液（MES pH5.0、PBS pH7.4和Tris-HCl pH7.4）中的至少能稳定存在24h以上。OdDHLS分子被固定在磁珠表面，以便进行固相筛选。通过普通和竞争SELEX技术，我们共筛选出8个与OdDHLS结合的核酸适体。这8个核酸适体可分为三组，第一和第二组只能与OdDHL或BHL结合，第三组与OdDHL和BHL都能结合。所得核酸适体与OdDHL和BHL的亲和力较高（Kd<50nM）。.我们挑选出与OdDHL和BHL都能结合的核酸适体ALSap8进行体外抗毒力研究和动物感染模型的抗感染研究。结果发现，ALSap8能有效干扰铜绿假单胞菌的QS系统，进而显著降低铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA） PA合成和分泌LasB elastase、LasA protease和pyocyanin，并抑制PA形成生物膜，从而降低PA和毒力。. 三种典型的格兰阴性菌——大肠杆菌（ATCC 25922）和MDR鲍曼不动杆菌（ATCC 19606）在PA、产ESBLs的大肠杆菌（ATCC 25922）和MDR鲍曼不动杆菌（ATCC 19606）的裸鼠皮下感染模型的研究中，我们发现ALSap8能够显著抑制三种细菌在动物体内的扩散，抑制率均在64%以上，这表明ALSap8能有效控制感染。ALSap8治疗后的PA、EC和AB组的动物存活率分别为83.33%、50%和66.67 % 均显著高于未经治疗的阴性对照。这表明ALSap8典型革兰阴性菌的感染具有较好的保护作用。