暗孢耳霉类Cyt昆虫毒素蛋白对竹蚜的生物防治作用机制

The frequent outbreaks of aphid disaster severely weaken the economic production and ecological service functions of bamboo forests. In the previous study of our research group, the obligate aphid pathogen Conidiobolus obscurus exerted the regulation of the population development of bamboo aphids, and a Cyt-like insecticidal crystal protein that originally produced by Bacillus thuringiensis was found highly expressed in this fungal entomopathogen. This research project aims to study the biocontrol mechanism of C. obscurus-produced Cyt entomotoxin against the bamboo aphids on the gene, protein and host levels. Firstly, using the method of immunostaining and microscopic observation to figure out the main area and infection phase of Cyt-coding gene expression in host bodies of the infected bamboo aphids. Secondly, constructing the heterogenous expression system of Cyt-like protein to obtain the purified toxin, using the in vitro experiment of cell toxicology to figure out the main target host cells and the processing of the toxin activation, and investigating the key functional sites of Cyt based on the site-directed mutagenesis and bioassays. Thirdly, transcriptomic and microbiome insight into the response mechanism of the host aphid and its symbionts to the fungal infection and Cyt toxin, to analyze the interaction among the host-symbionts-pathogen for disclosing the relationship between host susceptibility and the fungal biocontrol effect. This research favors the application of the fungal-originated Cyt toxins in aphid control, improves the understanding of the biocontrol mechanism of Entomophthoromycota against the agroforestry pests, and develops the sustainable pest management in bamboo forests.

蚜害频繁爆发严重削弱竹林的经济产出和生态服务功能。本研究团队前期研究表明，蚜科专化真菌暗孢耳霉对竹蚜种群增长具有调控作用，同时发现其高表达类苏云金杆菌产的杀虫晶体蛋白Cyt。本项目计划从基因、蛋白和寄主三个水平探索暗孢耳霉类Cyt蛋白对竹蚜的生物防治作用机制。通过免疫荧光标记显微观察，探明cyt基因在寄主竹蚜体内表达的主要区域和侵染阶段；通过构建异源表达体系获得纯化Cyt蛋白，采用离体细胞毒理实验明确其主要靶标细胞和毒素活化方式，并利用位点定向突变和生物测定明确其关键作用位点；通过转录组学和内生菌群分析寄主竹蚜对暗孢耳霉侵染及Cyt毒素的响应机制，解析寄主—内生菌群—病原真菌三者互作关系，揭示寄主易感性和病原生防作用的关联。本项目的开展将有利于开发真菌源Cyt基因资源及在控蚜上的应用，进一步阐释虫霉门生防真菌在农林害虫防治中的作用，助力竹林等重要森林资源的可持续害虫管理。

Cyt蛋白早先发现于昆虫病原细菌，后陆续被报道在真菌中有类似蛋白，但功能未明。本项目四年执行期间，紧紧围绕昆虫病原真菌暗孢耳霉类Cyt基因（CytCo）的生防作用机理展开研究，发现其可诱导昆虫免疫细胞凋亡或坏死，是病原侵染及致死寄主的关键毒力因子。从基因水平上，明确暗孢耳霉CytCo全长序列信息，预测了该蛋白的三维立体结构为数个α螺旋环绕中心β折叠二级结构组成单一结构域。接着，分析了该基因表达特性，发现低于最适生长温度或添加昆虫血糖成分海藻糖可上调基因表达，及其表达与病原致死竹蚜具有高度关联性，确认其是暗孢耳霉毒力的关键因素。从蛋白水平上，通过异源表达实现高纯度的CytCo蛋白生物合成，利用荧光标记示踪其在靶标生物中的具体作用区域，同时发现其对松材线虫也具有致死作用，可诱发肠壁细胞凋亡。另一方面，结构缺失或同类蛋白的生物测定结果显示，部分缺失蛋白或近似结构蛋白对靶标生物的致死作用显著下降，说明CytCo结构完整对其功能的重要性。从寄主水平上，发现寄主竹蚜体内菌群对暗孢耳霉侵染具有潜在协同作用，可在宿主感病状态下转变为致病菌。同时，寄主在对毒蛋白和化学农药作用的分子响应上差异明显，尽管两者生物测定观察结果相近。毒蛋白对靶标生物的影响不仅局限在免疫系统，对寄主的代谢、信号传导、转录调控、神经系统等相关基因的表达都具有显著影响。进一步观察CytCo处理的离体昆虫血细胞，发现可在数小时内促发细胞坏死，大幅减少昆虫血淋巴中的细胞浓度，为病原成功侵染寄主创造有利条件。此项目研究成果有利于进一步开发昆虫病原真菌功能基因资源，解析病原与寄主等互作关系及致病机理，助力农林有害生物的绿色防控。项目主持人近四年以一作或通讯作者发表相关SCI论文6篇，获国家发明专利1项，完成了项目的预期目标。