高产脂肪醇人工大肠杆菌全局调控策略的研究

Global manipulation is the efficient way to improve the production of chemicals in artificial cells. But the random global manipulation still has the disadvantages of low accuracy and wasting time. These problems limit its applications, especially in the artificial production of chemicals (e.g. fatty alcohols) which cannot be detected by high throughput means. Thus, the applicant proposes the idea of from single-point to global manipulation. This idea offers more rational and accurate global manipulation strategy, which will improve the capibility of artificial cells for chemicals production. This project firstly attempts to inhibit and enhance single gene expression in genome, and identify the target genes that need to be manipulated determined by fatty alcohols production. Cells change information after effective perturbation will be revealed in transcriptional and translational level, which then is applied to develop more accurately semi-rational global manipulation. After establishing robustly high fatty alcohols production strains by global manipulation, the mechanism and accuracy of manipulation will be revealed by transcriptomics, proteomics and metabonomics analysis. This proposal provides new insight and solution for accurate global manipulation.

全局调控能够有效提高人工细胞合成化学品的产出能力。但是随机的全局调控还具有准确度不高、时耗较长的问题，因此限制了其在无法进行高通量筛选的化学品（如脂肪醇）人工合成中的应用。申请者提出从单点扰动到全局调控的思路，提供更加理性、精确的全局调控的策略，用以提高人工细胞合成化学品的能力。本项目尝试首先通过单点抑制和增强基因组内靶向基因的表达强度，以脂肪醇产量为输出，筛选基因组中经正负扰动后促进脂肪醇人工合成能力的基因靶点，从转录和翻译的层面解析扰动后细胞变化的信息，用于理性指导更为精确的半理性全局调控，构建高鲁棒性的脂肪醇高产菌株，并在转录组、蛋白组和代谢物组的差异层面，解析半理性全局扰动的准确性和调控机理。该项目为精确的全局调控提供了新的思路和解决办法。

全局调控能够有效提高人工细胞合成化学品的产出能力。但是随机的全局调控还具有准确度不高、时耗较长的问题，因此限制了其在无法进行高通量筛选的化学品（如脂肪醇）人工合成中的应用。申请者提出从单点扰动到全局调控的思路，提供更加理性、精确的全局调控的策略，用以提高人工细胞合成化学品的能力。.为完成本项目提出的研究目标，申请人从以下几个方面开展了系统的研究：首先，我们构建了用于大肠杆菌脂肪酸代谢调控的CRISPRi系统并对脂肪酸代谢路径或调控相关的5个模块内的共108个基因的表达进行抑制，识别到30个有效基因。对这30个基因的表达强度进行优化，其中5个基因对应的脂肪酸产量进一步提高。在这30个基因中，有20个基因对应的调控使脂肪酸产量提高50%以上。其次，基于基因表达和产物产量，我们选出LihfA，HfadR和OfadR这3菌株做了转录组和蛋白组分析。通过比较3菌株共同上下调基因和转录组KEGG富集情况，我们挑选出24个上调基因和22个下调基因，并通过反馈验证实验筛选到26个有效靶点。然后，我们将这26个基因进行了功能划分和权重值计算，并对生物膜、运动性以及NADH相关的ROS进行了验证，从细胞状态或细胞结构的层面去发掘对脂肪酸合成有效的信息。最后，我们进行了不同策略的两点组合抑制实验，探索不同组合方式对脂肪酸产量的影响，结果显示组合改造转录调控因子与细胞状态或细胞结构有关的基因，则更有利于进一步提高脂肪酸的产出。研究得到了高鲁棒性的脂肪酸高产菌株，并解析得到了半理性全局扰动的准确性和调控机理，为精确的全局调控提供了新的思路和解决办法。圆满的完成的项目的研究目标和研究内容。.该项目执行期间，项目组成员分工协作，申请人以第一和通讯作者为本项目发表论文4篇，其中3篇SCI高水平论文，还有2篇SCI高水平论文在投。申请中国发明专利1项。协助培养硕士生3人，博士生1人。圆满完成项目指标。