基于青霉素发酵液催化转化的青霉素酰化酶纳米复合柔性固定化载体研究

The pollution of penicillin G (PG) predominantly originates from its low recycle efficiency. The purification study on its hydrolyzed product 6-APA foresees the novel recycle procedure with high efficiency, whose core part lies in the conversion of PG to 6-APA from fermentation solution. This project aims to design a novel magnetic polymer nanocomposite PA carrier facilitating to the direct conversion of PG to 6-APA in fermentation solution. By spectroscopically probing the interactions between microenvironment-PA interactions at molecular level, the microenvironment, immobilized functionalities and impurities impact on PA structure and activity will be addressed. Furthermore, by studying the grafting density, target-spot density, polymer molecular weight as well as contained impurities, the structural effect on loading capacity, response rate and recycle rate will be explicitly elucidated as well. The project is expected to gain a systematic understanding of structure-properties relationship between microenvironment and PA, which widens carrier-design window by providing the theoretical and technical foundations for novel carrier design and propels the industrial development.

青霉素G(Penicillin G, PG)低回收率是青霉素污染的主要原因，课题组对其水解产物6-氨基青霉烷酸(6-aminopenicillanic acid, 6-APA)的纯化研究结果展现出未来开发高回收率青霉素原料药新工艺的前景，发酵液中PG的6-APA转化是该工艺核心。本项目旨在设计合成一种固定青霉素酰化酶 (Penicillin acylase, PA) 的新型磁性纳米复合聚合物载体，直接将发酵液中的PG催化转化成6-APA。通过结合多种光谱和波谱技术，在分子水平剖析微环境与PA相互作用，揭示微环境、固定化靶点功能基以及杂质对PA结构和活性的影响机制。通过研究接枝密度、靶点设置密度、聚合物分子量和内含杂质影响，阐明载体结构对负载量、响应速率和回收率的影响规律。本项目将对微环境与PA的构效关系形成系统认识，并拓宽载体的设计思路，为新载体设计提供理论指导和技术支撑，推动该行业发展。

β-内酰胺类抗生素菌活性强、毒性低、适应症广及临床疗效好，但长期使用会导致细菌耐药性，合成不同类型的β-内酰胺类抗生素是减缓耐药性通用方法。6-烷基青霉素烷酸(6-APA)是合成中的关键中间体，可通过青霉素酰化酶(PGA)催化水解青霉素G来生产。PGA由α和β两个亚基通过分子间作用力自组装而成，稳定性差，环境和机械作用易破坏其结构，且难从体系分离，因此，常以固定化形式应用。当前固定化PGA主要存在以下不足：1.活性损失严重；2. 固定化PGA的响应速率、负载量和回收率三性能间的矛盾难平衡。结果导致固定化PGA的催化作用长期处于低水平层次循环，使产品成本高。因此，通过结构和微环境设计制备新型载体，解决酶活保留率和实现响应速率、负载量和回收率三性能在高水平上的平衡，是本项目研究的核心。本项目设计合成了一系列新型载体，并研究了载体结构与负载量、响应速率和回收率的关系，以及载体微环境和靶点类型、间距与固定化酶活力间的关系，取得了一些有意义和显示度的成果。主要内容涵盖以下几个方面：.(1) 研究了游离PGA在含各种功能基的不同有机溶剂中及不同离子类型和浓度的水溶液中催化活性的变化规律，归纳了PGA得出有利于PGA发挥催化活性的最佳功能基及离子环境，分析了其中的原理和机理。.(2)基于(1)的成果，设计合成了系列三嵌段温敏性聚合物PDEA-b-PGMA-PHEMA、PDEA-b-PHEMA-b-PGMA、PDEA-b-PHEMA-b- P(HEMA-co-GMA)和PDEA-b-PHEMA-b-P(MMA-co-GMA)载体，将其用于固定化PGA，综合比较后发现：制备的载体PDEA-b-PHEMA-b-(MMA-co-GMA)固定化PGA的酶活回收率最大，达68 %，且PGA负载量大、响应速率快。研究发现随着靶点间距的增大， PGA活性逐渐增大，MMA更适合作为调整靶点间距的共聚单体，并分析了其原理和机理。.(3)基于(2)的成果，制备了磁性纳米复合PDEA-b-PHEMA-b- (MMA-co-GMA)载体，发现复合载体固定化PGA的活性增加到93.48%，且PGA负载量高、响应速率快、回收简单、回收率高。.(4) 此外，项目还结合酶固定化的最新研究成果，考察了其它固定化方法的影响，结果表明，环氧作为靶点、多羟基环境更有助于提高PGA活性，靶点间距对酶活有较大影响。