决定墨兰叶艺（叶色变异）性状的分子调控机制研究

Leaf variation is an very important character for the horticultural and economic value of Chinese Cymbidium. It also become one of the main development trend of Cymbidium breeding. However, the mechanism of leaf variation is still poorly understood. In our previous work, we sequenced the transcriptome of Cymbidium 'Dharma', which is a well-known orchid species in Cymbidium sinense with highly variable leaf arts, and analyzed the difference of gene expression profile between the normal and the variated leaves using DGE(Digital gene expression). Our results showed that the chlorophyll degradation is greater than the synthesis in mutation leaves, and the genes involved in cellular metabolic pathway are highly expressed as well as the WRKY transcription factors. We therefor speculated that the excess degradation of chlorophyll mainly caused leave color variation,and the WRKY transcription factors may be involved in regulating this process.On this basis, this project will focus on chlorophyll metabolic pathway, clarify the functions of the key enzyme genes for chlorophyll degradation firstly, and then screen the regulatory factors which affect chlorophyll content through transcriptome profiling, (especially focus on WRKY transcription factor and the downstream responsive genes ), in order to initially reveal the molecular basis of the regulation of leaf color variation. Our study will provide valuable data and practical guidance for improving the horticultural traits and molecular breeding in Cymbidium.

叶色变异性状是国兰园艺观赏和经济价值的重要指标，也是国兰品种选育的主要发展方向之一，而长期以来，对调控国兰叶色变异性状的分子机制还知之甚少。我们以变异发生率最高的墨兰'达摩'品种为研究对象，首次完成其转录组测序及变异叶片基因表达谱差异分析。发现变异叶片体内叶绿素降解大于合成， 且细胞降解代谢途径相关基因和WRKY转录因子被显著诱导表达。推测叶绿素过量降解是造成叶色变异的主要原因之一，且WRKY转录因子可能在其中发挥重要调控作用。本项目将深入研究墨兰叶绿素代谢通路，阐明叶绿素分解代谢途径关键酶基因功能，并在转录组水平找出影响分解代谢途径的关键调控因子，重点研究WRKY转录因子及其下游应答基因的调控机制，建立墨兰叶色变异性状的分子调控模型，为墨兰园艺性状改良及分子育种提供切实可行的理论指导。

墨兰在栽培驯化过程中容易产生高频率的叶色变异现象，这种叶色变异的性状显著提升了墨兰的园艺以及经济价值，使其在中国乃至东南亚的花卉市场上广受欢迎。但目前关于墨兰叶色变异的机制尚不清楚。本项目以墨兰‘达摩’正常绿叶和叶色突变体为研究对象，在生理、细胞以及分子水平上综合分析了叶色变异产生的原因。主要结论如下：1) 叶绿素含量测定结果表明，叶色突变体黄色区的总叶绿素和类胡萝卜素含量均小于绿色区，且总叶绿素含量降低更为显著，造成Caro/总Chl比值升高，叶色黄化。2) 对叶绿体超微结构进行分析，发现与野生型绿色叶片相比，叶色突变体绿色区域叶绿体具有典型的功能结构，而黄色区的叶绿体退化严重，没有完整的叶绿体结构。3）与叶色突变体绿色部分相比，黄色部分参与叶绿素降解的关键酶活以及中间产物含量均差异显著性提高，同时定量PCR结果发现4个参与叶绿素降解的基因表达量在黄色部分呈现差异显著性上调。4）在拟南芥中超表达CsPORA和CsCLH，转基因植株在黑暗处理一周后测定其处理前后的叶绿素含量发现CsPORA超表达植株叶绿素含量降低量较野生型低，而CsCLH超表达植株的降低量较野生型高。5）基于转录组测序数据，从墨兰中筛选得到52条CsWRKY转录因子序列。通过定量PCR分析了21个CsWRKY转录因子以及11个叶绿素合成代谢相关酶对6种植物激素信号的响应。结果表明在叶艺品系中表达最为显著的3个CsWRKY同时也在激素响应中强烈表达。6) 采用酶联法检测对不同叶艺品系中内源激素（ACC、ABA、JA、SA、IAA）含量测定发现，仅有ACC的含量在所有品系均为黄色区高于绿色区。7）进一步通过DGE差异分析发现，所有被鉴定到的乙烯应答因子ERF在叶艺品种黄色叶片体内都有显著高表达。通过生物信息学分析筛选发现CsERF13可能在墨兰叶绿素降解过程中具有重要的调控作用。以上结果从生理学、细胞学以及分子生物学的角度阐述了墨兰叶色变异形成的机理，发表论文7篇，其中SCI论文4篇，申请国家发明专利2件，培养研究生3人，研究结果将为今后墨兰园艺性状改良及分子育种提供可参考的理论依据。