运用CRISPR-Cas9基因编辑技术研究‘中红杨’叶色变异的分子调控机制

Poplars have advantages of fast growth, strong adaptability, and easy propagation, which are widely used in road greening and landscape configuration. However, the single green leaf of poplars severely limits their application. Therefore, the cultivation of colored-leaf poplars is an important breeding goal in poplar. However, the underlying molecular mechanism of leaf color mutation in poplar remains unknown, which limits the cultivation and improvement of colored-leaf poplar. Therefore, it is of great theoretical value and application potential to study the molecular mechanism of leaf color mutation in poplar. ‘zhonghong’ poplar, a bud sport from Populus sp. Linn 2025, has four kinds of leaf color during three seasons in one year, which is an ideal material to study the molecular mechanism of leaf color mutation in poplar. In this project, we will evaluate the content difference of anthocyanins between the ‘zhonghong’ poplar and 2025 poplar (control) to explore the physiological mechanism of leaf color mutation in poplar. Based on this analysis and the results obtained from the whole genome resequencing, quantitative real-time PCR will be used to mine the candidate genes associated with leaf color mutation. And CRISPR/Cas9 system will be used to verify the functions of candidate genes, and make sure which genes take an important role during the leaf color mutation of ‘zhonghong’ poplar. This study will not only reveal the molecular mechanism of leaf color mutation of ‘zhonghong’ poplar, but also provide a theoretical basis for cultivation and improvement of colored-leaf plants in Populus.

杨树具有生长速度快、适应性强、繁殖容易等优点，广泛应用于道路绿化及园林景观配置，但叶色单一的缺点严重限制了其应用。因此，培育更多的彩叶杨新品种是杨树育种的一个重要方向。目前人们对杨树叶色变异分子机制的研究还相当匮乏，极大的限制了彩叶杨的培育，因此研究杨树叶色变异的分子机制具有重要的理论价值和应用潜力。‘中红杨’是2025杨的芽变品种，叶色三季四变，是研究杨树叶色变异机制的理想材料。本研究拟以‘中红杨’为试验材料，2025杨为对照，采用HPLC-DAD-HRMS技术测定二者之间花青素苷的含量差异，探索‘中红杨’叶色变异的生理机制；然后结合全基因组重测序及荧光定量PCR技术挖掘与花青素苷合成相关的候选基因，采用CRISPR/Cas9系统解析候选基因在杨树叶色变异中的分子功能。杨树叶色变异候选基因分子功能的成功解析，不仅深入揭示了杨树叶色变异的分子调控机制，还为杨属彩叶植物的培育提供了理论依据。

杨树具有生长速度快、适应性强、繁殖容易等优点，广泛应用于道路绿化及园林景观配置，但叶色单一的缺点严重限制了其应用。因此，培育更多的彩叶杨新品种是杨树育种的一个重要方向。目前人们对杨树叶色变异分子机制的研究还相当匮乏，极大的限制了彩叶杨的培育，因此研究杨树叶色变异的分子机制具有重要的理论价值和应用潜力。‘中红杨’是2025杨的芽变品种，叶色三季四变，是研究杨树叶色变异机制的理想材料。本研究发现5月初、8月初中红杨叶片花青素苷以矢车菊素和芍药素为主，10月初、11月初中红杨叶片花青素苷以天竺葵素和飞燕草素为主。从中红杨叶片萌芽到8月初，中红杨嫩叶以红色为主，因此，矢车菊素和芍药素含量的增多是其叶片呈现红色的主要原因，10月初到11月初，由于秋季温度降低，类胡萝卜素的含量增加，矢车菊素和芍药素的浓度有所降低，再加上天竺葵素和飞燕草素含量的增加，导致叶片呈现黄褐色的变化。通过对彩叶杨树全基因组重测序分析、转录组学分析、MYB基因家族分析以及候选基因的表达模式分析确定了DFR和MYB113基因作为候选基因进行基因功能验证。运用CRISPR/Cas9系统，采用农杆菌介导法获得了转MYB113基因山新杨和转DFR基因山新杨，结果表明DFR基因对花青素苷合成相关的基因及含量没有产生显著的变化，不是叶片颜色形成的关键基因。转MYB113基因山新杨中一些花青素苷的含量发生了显著的变化，与花青素苷合成相关的基因，尤其是上游基因群（PAL,CHS,CHI,F3H,DFR）发生了显著变化，表明MYB113基因对花青素苷合成相关的基因有调控作用，同时对花青素的合成产生作用，可以进一步研究该基因调控花青素苷合成的深入机制。本项目的实施很好的揭示了杨树叶片颜色形成的生理机制，初步揭示了杨树叶片颜色形成的分子机制，为将来们研究植物叶片颜色的形成机制及创制彩叶植物提供了很好的参考。