恩诺沙星诱导哈维弧菌产生多重耐药性的分子机制研究

Vibrio harveyi is one of the most common pathogenic bacterium in mariculture in recent years. Using antibiotics is still an important means to control the vibrio diseases in aquaculture. Enrofloxacin has been designated as an specialized antibiotic for animals in China. It has a long history of clinical application. But the latest results have shown that marine vibrio's resistance to enrofloxacin was rising. Moreover, our results of the preliminary research suggested that enrofloxacin not only induced the pathogenic V. harveyi resist to the similar drugs, such as ciprofloxacin and norfloxacin, but also induced it resist to streptomycin, furazolidone, rifampicin and doxycycline. It meaned that the sensitive strain had acquired multiple resistance. Therefore, in the study, the mechanism of multi-drug resistance in V. harveyi induced by enrofloxacin will be analyzed, with next generation sequencing and gene knockout technology, etc. The pre-test transcriptome data will also be provided for correlation analysis. The aim is to identify the key genes and the related sites, and resolve the molecular mechanism of multi-drug resistance in V. harveyi induced by enrofloxacin. The scientific problem of this project comes from the global hot spot "the formation of bacterial drug-resistance", hoping to make a new breakthrough in the study of the mechanism of drug-resistance for aquatic bacteria by the latest science and technology, and make pioneering achievements.

哈维弧菌是近年来海洋动物养殖过程中出现频率最高的致病菌之一。使用抗生素仍是目前防治弧菌病的重要手段，其中恩诺沙星被国家指定为动物专用药，具长时间临床应用史，而最新研究结果显示海洋弧菌对恩诺沙星的耐药率不断上升。最值得关注的是，恩诺沙星不但可诱导哈维弧菌对同类药物如环丙沙星、诺氟沙星等产生抗性，还可在短时间内使敏感株对链霉素、呋喃唑酮、利福平、强力霉素等产生抗性，提示敏感株已转变为多重耐药株。因此，本项目以病原哈维弧菌为研究对象，拟通过三代测序分析、基因敲除等技术，结合前期转录组数据基础，确认与多重耐药相关的关键基因及位点，明确各关键基因在恩诺沙星诱导过程的突变的次序及各诱导期表达量的变化规律，综合解析恩诺沙星诱导哈维弧菌产生多重耐药性的分子机制。本项目的科学问题来源于全球关注的热点“细菌耐药性的形成”，以期通过最新科学技术，对水生细菌的耐药机制研究有新的突破，取得开拓性成果。

本项目原定计划采用基因敲除技术使受试哈维弧菌缺失了recA基因（通过PCR检测技术确认recA基因已缺失），然而在研究过程中发现受试哈维弧菌在缺失recA基因后通过培养基培养长出的菌落迅速恢复为野生型，经过多次重复实验，确认无法通过分离培养得到缺失recA基因的突变株，故无法验证缺失recA基因的突变株对恩诺沙星的抗性变化。为了项目的进一步顺利实施，以反向调控的原理，通过过表达与recA基因对立的另一个关键基因——lexA基因（阻遏或关闭SOS应答系统）使阻遏recA基因的表达，并借助过表达技术成功构建了lexA基因过表达突变株，进一步通过培养成功获得了过表达lexA基因的突变株，经药敏测试显示过表达lexA基因的突变株对恩诺沙星的抗性明显减弱，因此反向证实了SOS应答系统参与调控哈维弧菌对恩诺沙星的抗性。同时，通过进一步分析（包括对菌株全基因组及转录组数据的深入分析、荧光定量验证分析等），明确以下关键基因包括acrR、fadR、gntR、marR、lexA在哈维弧菌产生多重耐药性的过程中发挥关键作用。综上，初步确定了SOS应答系统与外排泵系统均参与调控哈维弧菌多重耐药性的形成。. 依托该项目，已公开发表共8篇，其中SCI 论文5篇（总影响因子大于28，均以本项目为第一标注）、核心期刊论文3篇，已获授权实用新型专利1项，已出版专著1部（参编，内容相关）。另外，拟申请软件著作1件，继续投稿相关研究论文2篇（第一标注）。总体研究计划按合同书进行，基本完成任务书研究目标和各项考核指标。项目下拨直接费用21万元，已开支7.1759万元，结余占比为54.86%（由于疫情影响，项目部分开支项目未能及时结算，包括实验周期较长的测序项目，目前约有3万元未报账；涉及采样调研工作未能按期开展，差旅费用开支存在滞后等问题；以及实验材料费用需入库审核，期间涉及各系统的升级等问题，报销流程较长，至今未能及时入账，开学后将尽快推进滞后的票据报销工作，确保项目按计划完成预算开支）。