矮牵牛转录因子PhERF2调控病毒诱导基因沉默的机理解析

Virus-induced gene silencing is a natural antiviral mechanism in plants, but there are few researches on its transcriptional regulation at present. In previous studies, we found that a key silencing-related transcription factor, PhERF2, positively regulated Tobacco rattle virus (TRV)-induced gene silencing efficiency and expression of RNA silencing-associated genes, and participated in the defense responses to TRV and Cucumber mosaic virus (CMV) in petunia. In this project, we will obtain the full-length and promoter sequences of PhERF2’s downstream target gene through expression profile and ChIP-seq analysis, using wild-type, PhERF2-RNAi and -overexpressing transgenic petunia plants as materials. Next, qRT-PCR will be performed to analyze the expression levels of PhERF2 after virus infection. The physical binding of PhERF2 to the promoter of its target gene will be tested using yeast one-hybrid and dual luciferase assay. We will determine the regulatory role of target gene in TRV-induced gene silencing efficiency and defense against virus infection via virus-induced gene silencing and genetic transformation. Ultimately, the research results could reveal the molecular mechanism of PhERF2-modulated virus-induced RNA silencing, and provide a theoretical support for antiviral breeding of ornamental horticultural plants.

病毒诱导基因沉默是植物的一种天然抗病毒机制，但目前有关其转录调控的研究较少。前期我们在矮牵牛中发现了一个沉默系统关键转录因子PhERF2，调节烟草脆裂病毒诱导的基因沉默效率和RNA沉默通路相关基因的表达，并且参与防御烟草脆裂病毒和黄瓜花叶病毒侵染过程。本研究拟通过矮牵牛野生型、PhERF2的RNA干扰及过表达植株的全基因组表达谱分析，结合进一步的ChIP-seq筛选，获得PhERF2下游直接作用的靶基因全长及启动子序列；然后利用qRT-PCR分析病毒侵染的靶基因表达模式；利用酵母单杂交和双荧光素酶实验，研究PhERF2与靶基因启动子的结合关系；通过病毒诱导基因沉默和稳定遗传转化，验证靶基因影响基因沉默效率及抗病毒功能。最终阐明PhERF2转录调控病毒诱导的RNA沉默分子机理，为观赏园艺植物抗病毒育种提供理论支持。

病毒诱导基因沉默（VIGS）是植物抗病毒侵染的一种自然机制，无论从抗病毒层面，还是技术应用层面，VIGS已成为植物功能基因组学领域的研究热点。然而到目前为止，植物体内由病毒侵染导致的RNA沉默调控机制仍然不完全清楚。. 为了解决该问题，本项目主要研究内容包括：PhERF2转录因子下游直接靶基因的筛选；靶基因生物信息学及病毒侵染的表达模式分析；PhERF2转录因子与靶基因启动子结合关系验证；靶基因调控VIGS沉默及抗病毒功能研究。除抗病毒之外，我们针对PhERF2抗灰霉菌侵染和水涝胁迫功能同样开展了深入的研究。. 获得的重要结果和关键数据包括：通过DAP-Seq技术挖掘到了PhERF2下游多个靶基因，结合酵母单杂交、双荧光素酶、凝胶迁移阻滞实验，验证了PhERF2与靶基因启动子的结合关系；PhERF2通过作用于PhSDR2，介导脱落酸合成途径，调控VIGS沉默效率及抗病毒反应；PhERF2通过转录激活PhERF16，介导茉莉酸/乙烯信号通路，调控抗灰霉菌侵染过程；PhERF2与下游PhADH1-2共同参与矮牵牛对涝害胁迫的耐受过程。. 综上所述，本项目通过PhERF2下游靶基因的发掘与功能鉴定，构建了PhERF2下游转录调控的完整网络，对于完善植物的抗病毒RNA沉默分子机制具有重要科学意义，而PhERF2其它抗性功能研究，可进一步丰富我们对生物胁迫和非生物胁迫之间互作机理的认识。从而在生产实践上，为矮牵牛及其它观赏园艺植物利用转基因手段培育新品种，改良矮牵牛等植物抗性，提供重要方法和基因资源。