DBP对大鼠睾丸支持细胞波形蛋白骨架系统的损伤及其信号转导机制研究

邻苯二甲酸二丁基酯（di-n-butyl phthalate, DBP）是邻苯二甲酸酯类物质中应用较为广泛的人类合成化合物，在环境中分布非常广泛，并具有确切的男（雄）性生殖毒性。申请人前期的研究结果及文献资料表明，DBP对睾丸支持细胞波形蛋白细胞骨架系统的破坏是其生殖毒性的重要表现形式，但缺乏深入研究。本研究试图从DBP对支持细胞波形蛋白的破坏机制入手，研究DBP暴露后支持细胞波形蛋白及其组成的细胞中间纤维骨架系统和桥粒结构的变化以及其间发生的细胞事件，从细胞骨架角度阐述DBP的生殖毒性机制，并探索从DBP暴露到波形蛋白表达及磷酸化改变过程中细胞信号途径的阻遏是否可逆转DBP对支持细胞的破坏作用。本课题的研究结果将为深度阐明DBP对支持细胞破坏作用的细胞信号转导机制提供有用线索，而且可为针对其关键信号途径进行DBP的预防提供实验证据。

本课题的研究目标为：1.从细胞骨架角度阐述DBP致睾丸支持细胞损伤作用的机制，检测DBP处理后支持细胞波形蛋白及其组成的中间纤维细胞骨架系统及桥粒结构的变化；2.研究支持细胞从DBP暴露到波形蛋白细胞骨架系统破坏过程中的细胞事件，主要围绕PPARa激活以及下游信号通路再其中的作用展开研究；3.用上述信号通路的阻断剂处理细胞后观察是否可逆转DBP对波形蛋白骨架系统的破坏作用，为有针对性地预防DBP的损伤作用提供实验证据。.围绕上述研究目标，课题组三年来取得如下研究结果：. 1.建立了大鼠睾丸支持细胞培养模型及DBP、MBP染毒模型。实验结果证明，相同剂量的DBP较MBP对支持细胞波形蛋白骨架系统的破坏作用更为强烈。100μMDBP处理睾丸支持细胞后细胞波形蛋白骨架系统呈现显著降解，并由此引发了支持细胞的皱缩，PPARa的抑制剂GW6471可显著逆转DBP对波形蛋白骨架系统的降解。. 2.研究了DBP对大鼠PPARa信号通路的活化作用。DBP处理后，支持细胞PPARa呈激活状态，其表达显著增加，并由胞浆转移至细胞核内，其激活的PPRE转录因子也显著激活。. 3.研究了PPARa信号通路在DBP致睾丸支持细胞破坏作用中的机制。发现DBP处理后，支持细胞可溶性波形蛋白含量增加，其磷酸化水平也显著增加，而PPARa的抑制剂GW6471可逆转可溶性及磷酸化波形蛋白的增加。说明PPARa导致的波形蛋白磷酸化是导致其降解的主要因素。. 4.研究了PPARa下游信号通路对波形蛋白磷酸化的影响。发现DBP处理后Smad2/3表达下降，P-P38及P-Erk1/2表达上升，P-jnk1/2表达未明显改变，而PPARa的抑制可逆转Smad2/3的下降和P-Erk1/2的上升，而抑制Erk后波形蛋白的磷酸化基本被抑制。说明Erk在PPARa激活后导致的波形蛋白磷酸化中其关键作用。. 本研究可得出结论：DBP处理睾丸支持细胞后，波形蛋白发生解聚，其解聚是由其磷酸化导致的，而DBP诱导的PPARa的活化对波形蛋白的磷酸化起至关重要的作用。由PPARa活化到波形蛋白磷酸化的过程中Erk的磷酸化是其中的关键步骤。. 本研究基本达到预期研究目标。目前已投递SCI论文一篇，正在修稿中。另成文一篇准备投递。