Rv1830通过调控RNA聚合酶活性参与分枝杆菌感染的作用机制

The successful infection of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) relies on its ability to sense and respond to environmental stresses produced by host cells. For bacteria, stress responses are primarily mediated through the regulation of gene expression. RNA polymerase is the only enzyme in charge of transcription in bacteria and is a key target for transcriptional regulation. Activators, which bind to Mtb RNAP to promote its activity, have been recently identified. However, repressor that interacts with Mtb RNAP to inhibit its activity remains to be characterized. In our previous work, we have found that an uncharacterized protein in Mtb, Rv1830, directly binds to Mtb RNAP and represses its activity. Based on these observations, we intend to investigate the mechanism for the regulation of Rv1830 to Mtb RNAP and reveal the physiological roles of this regulatory process. For this purpose, we will apply molecular, biochemical and genetic approaches to identify the amino acid residues essential for interaction between Rv1830 and Mtb RNAP proteins, to determine the transcription step(s) regulated by Rv1830 protein, and to explore the roles of this regulatory process in response to low pH, hypoxia, nutrition starvation, reactive oxygen and nitrogen stresses and in mycobacterial infection. This project will, for the first time, reveal the function of Rv1830 protein and clarify a mechanism for the repression to Mtb RNAP activity during infection, which will provide important information for developing new drug target(s) to control mycobacterial infection.

应对宿主产生的各种压力环境是结核分枝杆菌（Mtb）成功感染的关键环节，对负责转录的RNA聚合酶（RNAP）活性的调控在压力应答过程中发挥重要作用。目前已经发现多个Mtb RNAP的激活蛋白，但结合到Mtb RNAP抑制其活性的蛋白还未见报道。我们前期研究发现功能未知的Rv1830蛋白可以与Mtb RNAP相互作用，并抑制其转录活性。本项目拟在此基础上，采用分子、生化、遗传学等技术手段，鉴定Rv1830与RNAP的互作位点，确定Rv1830抑制RNAP活性的作用方式，探究该调控作用在分枝杆菌低pH、低氧、寡营养、活性氧、活性氮等压力应答和感染过程中的功能，系统阐释Rv1830抑制RNAP活性的分子机制及生理意义。本项目将通过揭示Rv1830蛋白的生理功能，回答RNAP活性抑制如何在分枝杆菌感染过程中发挥作用这一基础科学问题，将为针对转录及调控过程开发新的药物作用靶点提供理论依据。

属于 MerR 家族蛋白的转录调控蛋白 Rv1830 可能与 Mtb 的抗生素耐受相关，但其具体的调控靶标、调控机制以及与压力耐受（包括抗生素）之间的关系等都不清楚。本项目以 Rv1830 为对象，系统解析 Rv1830 介导的调控网络与分枝杆菌耐受抗生素和氧化压力的关系，并依据功能将其重命名为 McdR（mycobacterial cell division regulator）。取得的 主要结果如下：.1. 确定了McdR 是分枝杆菌保守的生存必需蛋白，直接与负责转录的RNA聚合酶之间存在互作，参与调节分枝杆菌细胞分裂和压力耐受。过表达 mcdR 会抑制细菌分裂，增加细菌长度，并且增加分枝杆菌对 rifampin（RIF）、isoniazid（INH）和 H2O2 的抗性。.2. 通过RNA-seq和RT-qPCR分析，我们发现 McdR抑制细胞分裂相关基因的表达，但激活DNA 复制与修复相关基因的表达，并且显著提高 MS 对 INH 的突变效率。利用 Dip-seq 在全基因组水平鉴定McdR的直接靶标，多序列比对、EMSA分析和体内荧光报告系统的结果都证McdR通过与“AATnACAnnnnTGTnATT”基序结合。.3. 结合细菌单杂交和体内荧光报告系统，我们发现 WhiB-like 家族蛋白（Wbl）的 WhiB2 能激活 mcdR的表达。通过启动子突变分析鉴定了 WhiB2 激活 mcdR 依赖于“cGACACGc”基序和 Wbl 家族 4 个保守的半胱氨酸残基。发现分枝杆菌利用 McdR 和 WhiB2介导的反馈调节网络精细调控细胞分裂的机制。.4. 对 NCBI 数据库中临床分离 Mtb 的全基因组测序数据进行分析，发现 mcdR 和 whiB2 的启动子序列高度保守，二者基因编码区存在一定的 SNPs，发现mcdR 的单核苷酸多态性影响其调控功能，进一步支持了 McdR-WhiB2 调控环在调节分枝杆菌细胞生长和耐药性方面的作用。.本项目揭示了 Rv1830/McdR 的调节作用及调控机制，提出了分枝杆菌利用McdR 和 WhiB2 介导的反馈调节网络控制细胞分裂的新模型，揭示了 McdR 调控DNA 突变频率增加 Mtb 压力耐受的新机制，为如何在治疗Mtb感染的同时控制耐药突变的产生提供了重要信息。