FNTB对巨噬细胞抗病毒免疫应答的调控及机制研究

The threat of a pandemic spread of highly virulent influenza A viruses currently represents a top global public health problem. During pathogenic influenza virus infection, robust cytokine production (cytokine storm), excessive inflammatory infiltrates, and virus-induced tissue destruction all contribute to morbidity and mortality. The modification of eukaryotic proteins by isoprenoid lipids, which is known as prenylation, controls the localization and activity of a range of immune cells. however, it remains unclear if prenylation play a role in influenza A viruses-triggered cytokine storm. Based on our preliminary experiment results, we raise hypothesis: The expression of farnesyltransferase is up-regulated in H1N1-triggered macrophages, that promotes expression of constitutively active Cdc42, thus results in increased the virus replication, which induces a dysregulated overly exuberant immune response, termed a "cytokine storm".

固有免疫系统对病毒的过度应答，引起炎症因子过量的“细胞因子风暴”致多器官衰竭是重症流感患者死亡的病理机制之一。甲羟戊酸途径产物-非固醇类复合物前体代谢对免疫系统的功能发挥有着重要的影响，但其是否参与流感病毒诱发的细胞因子风暴的形成尚未可知。我们发现H1N1感染显著上调巨噬细胞的非固醇类复合物前体代谢关键酶FNTB。并初步探明了FNTB高表达是巨噬细胞参与的细胞因子风暴产生的关键因素之一。拟在此基础上，通过基因敲除小鼠和体内外实验，验证我们的假说：高致病性流感病毒通过感染和刺激巨噬细胞，上调FNTB的表达，促进CDC42的活化，进而增加病毒复制，刺激RIG-I等信号，诱发过度的抗病毒免疫应答，造成干扰素和炎症因子的体内大量聚集，即细胞因子风暴的产生。研究结果有助于阐明细胞因子风暴形成机制，提出新的观点，并有望为临床治疗提供理论依据。

近年研究表明胆固醇代谢在抗病毒免疫应答中发挥重要的调节作用，而具体的机制尚未明确。法尼基焦磷酸（FPP）是胆固醇合成通路-甲羟戊酸途径的中间产物，同时也是众多类固醇和萜类物质的前体。而法尼基转移酶是胆固醇合成分支途径中的关键蛋白酶之一，蛋白法尼基转移酶可以将FPP加到某些靶蛋白上，使其发生法尼基化修饰，而修饰后的蛋白极性发生改变，更利于蛋白的膜锚定和活性功能的发挥。为了明确甲羟戊酸通路是否影响抗病毒免疫应答，我们选用了该通路的不同限速酶的抑制剂对巨噬细胞预处理，确定他汀药物及法尼基转移酶抑制剂处理都显著下调炎症因子的产生，同时，我们使用抑制剂抑制鲨烯的合成，未发现对病毒刺激后的巨噬细胞分泌炎症因子有影响，所以我们推断抑制甲羟戊酸途径对抗病毒免疫应答的影响是来自于某个或某些蛋白的法尼基化修饰受阻，而不是胆固醇合成障碍；为了进一步排除单个法尼基转移酶抑制剂的非特异效应造成了这个现象，我们使用了多种已知不同机制的法尼基转移酶抑制剂进行实验，发现不同抑制剂预处理巨噬细胞系及原代巨噬细胞产生的干扰素等前炎因子都显著下调；我们接着检测了法尼基转移酶基因FNTB的表达，发现该蛋白表达随着病毒感染时间的增加有一个下调的趋势，但这个下调并不明显，为了确定FNTB是否在抗病毒免疫应答中发挥作用，我们利用Crispr CAS9敲除FNTB筛选出稳定敲除细胞株，病毒感染后发现FNTB敲除同样显著下调干扰素等前炎因子的产生；而体内抑制剂预处理小鼠后腹腔注射VSV病毒，发现组织中干扰素等前炎因子表达下调，组织损伤更严重。我们的结果证明法尼基化修饰在抗病毒免疫中发挥了不可或缺的作用，提高了对胆固醇代谢与抗病毒免疫之间的交叉作用的理解，也为抗病毒免疫的临床应用提供了新的靶点方向与潜在临床药物。