肠道传染病病原体的快速筛查方法研究

针对现有病原体检测方法操作繁琐或快速检测方法通量不足的缺陷，在采用相同标签辅助-无引物二聚体（HAND系统）和荧光信号组合建立基因探针编码-荧光PCR方法的基础上，采用DNA连接技术、外源序列荧光杂交探针、靶序列杂交探针和改良分子信标等多个技术组合，建立基于探针溶解曲线-多重荧光PCR筛查46种肠道传染病病原体的方法。通过4个组合一次检测37种细菌、5种病毒和4种寄生虫，区分细菌性、病毒性和寄生虫性肠道传染病，检测时间从原来的6-7天甚至更长缩短到2小时，提高临床检测的准确率，指导临床的合理治疗和预防用药及控制抗生素的滥用。快速筛查方法的研究将为快速应对肠道传染病等突发公共卫生事件的应急检测和疾病监测提供技术支撑，服务于我国临床检验和传染病防控，保障人体健康和食品安全。

肠道传染病仍然是我国主要的疾病负担，发病数和发病率居我国传染病的前五位。引起肠道传染病的病原体主要包括细菌、病毒和寄生虫。针对现有病原体检测方法操作繁琐或快速检测方法通量不足的缺陷，我们采用相同标签辅助—无引物二聚体（HAND系统）、荧光信号组合、改良分子信标、多重连接依赖的探针溶解曲线等多个技术组合，建立基因探针编码-多重荧光PCR和多重连接依赖的探针溶解曲线-多重荧光PCR快速同时检测37种病原体（50个靶基因）的方法。通过五个组合（组合1：一管检测七种病毒；组合2:一管检测四种腹泻原虫；组合3：一管检测10种致病性弧菌；组合4：一管检测六种大肠杆菌；组合5:一管检测沙门菌、志贺菌等10种致病菌。）可一次同时筛查26种致病菌、7种病毒和4种腹泻原虫。.所建立的7种病毒快速检测方法的最低检出限为10copies/μl，和其他病原体无交叉荧光信号产生，扩增效率为87.6%-99.2%，三个平行样本Ct值误差小于1个循环数，批间差（变异系数）为0.06%-2.3%。可同时检测混合感染标本。共检测812份大便标本，和单色荧光PCR相比，其灵敏度为75% -100%，特异度为99% -100%. 两种方法的一致性为 97.8%-100% ，kappa 值为0.85-1.0。.所建立的4种腹泻原虫快速检测方法的最低检出限为10copies/μl，批间差（变异系数）为0.23%-1.14%。共检测63份大便标本，该方法和传统方法的检测结果一致。.所建立的26种致病菌检测方法的最低检出限为1.36×106cfu/mL-1.5×108cfu/mL，和其他病原体无交叉荧光信号产生。.以病原体的标准检测方法作为对照，采用基因探针编码-多重荧光PCR和多重连接依赖的探针溶解曲线-多重荧光PCR共检测63份标本， 其中45份阳性，阳性率为71.43%。45份标本中，42份标本为病毒阳性，阳性率为65.08%；14份标本中检出病原菌，阳性率为22.22%；未检出常见腹泻原虫。单独病毒感染30份，单独细菌感染5份，细菌和病毒合并感染9份，2份病毒双重感染，1份细菌双重感染。该研究所建立的快速检测方法与病原体的标准检测方法结果一致，符合性好。.和现有文献报道的研究结果相比，多重连接依赖的探针溶解曲线-多重荧光PCR检测通量大大提高，突破了目前一管仅检测4-8个靶基因的极限，为国际首次