p73缺陷致NETs形成障碍在老年脓毒症肺损伤中的作用及机制研究

Septic lung injury is of high incidence in the elderly. The insufficiency in the understanding of its mechanisms and the lack of effective prevention and management made it one of the most serious diseases. Recently researchers found that septic lung injury is related to the dysregulation of neutrophil extracellular traps (NETs). Our previous studies revealed that the defect in NETs formation mediated by aging related down-regulation of ATG5 participated in the occurrence of lung injury in aged mice. P73 is the upstream gene that regulates the transcription and activation of ATG5. We found a down-regulated pattern of p73 with aging, but no report on its role during infection. Accordingly, we propose a hypothesis that the imbalanced NETs caused by p73 is important in the pathogenesis of lung injury in the elderly. This study consists of three parts: (1) to further clarify the interaction between NETs deficiency and septic lung injury; (2) to investigate the mechanism by which p73 regulates NETs formation both in vitro and in vivo; (3) to verify the therapeutic effect of potential p73 regulator (curcumin) in mice with septic lung injury. This study is expected to shed light on the pathogenesis and preventive strategy of septic lung injury in the elderly.

脓毒症肺损伤为严重威胁健康的重大疾病之一，在老年人高发，归因于免疫衰老，但确切机制不明，也缺乏有效防治手段。近来研究认为它与中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成失调有关。本课题组前期发现老年小鼠易发生脓毒症肺损伤，其机制与衰老致ATG5表达下调介导NETs形成缺陷有关。p73为调控ATG5转录激活的上游基因，我们前期初步发现它具有衰老相关性的表达下调，但在脓毒症中的免疫调节作用尚无报道。据此我们推出假说：中性粒细胞p73基因表达失调致自噬相关NETs形成缺陷是老年脓毒症肺损伤的重要发病机制。为验证该假说，拟首先进一步阐明NETs形成缺陷与脓毒症肺损伤的关系；然后在细胞和动物水平通过基因敲减和过表达等手段探讨NETs形成缺陷的p73基因调节机制；最后在老年脓毒症小鼠及其中性粒细胞上行活化p73的药物干预，验证其疗效。本研究有望阐明老年脓毒症肺损伤的发病机制和防治策略，为改善其预后提供新思路。

背景：老年患者易发脓毒症肺损伤。已有研究证明，老年人脓毒症时中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成减少，而自噬相关蛋白5（ATG5）的缺陷损害了NET的形成。p73已经被证明可以调控ATG5的转录，死亡相关蛋白激酶2 （DAPK2）是p73重要的下游效应因子，但它在NETs形成中的作用尚不清楚。本研究旨在检测p73-DAPK2通路缺陷是否与老年个体脓毒症中多形核中性粒细胞（PMNs）的自噬活性降低和NETs形成受损有关。.方法：用磷酸缓冲盐液或肽聚糖（PGN）体外刺激健康青年和老年志愿者静脉血中分离的PMNs，并采用盲肠结扎穿刺CLP）小鼠模型模拟体内脓毒症，通过基因转染、共聚焦显微镜及分子生物学等技术手段分别在体内外检测p73-DAPK2通路、自噬活性对NETs形成的影响及肺损伤的严重程度。.结果：（1）老年较青年人PMNs体外给与PGN刺激后，其NETs形成和自噬活性显著降低。老年较青年小鼠CLP后肺损伤更严重，肺泡灌洗液中NETs定量显著增加，肺部细菌负荷显著增加。（2）体外细胞培养结果老年较青年个体中性粒细胞自噬活性显著降低。（3）PMNs在体外刺激后，老年较青年患者中性粒细胞的p73表达显著降低，且相应的自噬活性及NETs形成显著减弱；基因转染试验进一步证实p73过表达可显著增加自噬水平及NETs形成能力。（4）PMNs体外刺激后，老年较青年的DAPK2水平显著降低；基因转染试验进一步发现，过表达p73，DAPK2的水平显著升高，而DAPK2敲除，阻止了自噬及NETs形成。.意义：本研究的结果表明老年较青年个体中性粒细胞p73-DAPK2通路存在缺陷，致自噬活性降低，NETs形成减弱，由此提示p73-DAPK2通路和自噬在维持PMNs抗感染功能中起重要作用。针对年龄相关性PMNs中p73-DAPK2通路缺陷可能是改善老年人群感染防御和减轻脓毒症肺损伤的潜在治疗方向。