猪肺炎支原体EF-Tu劫持H因子逃避宿主补体旁路途径激活机制研究

Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) is an important pathogen surviving long time in the host without being cleared. But its mechanism of evasion of the host immune system is not clear. The ability to effectively inhibit the complement activation of alternative pathway is the key to immune evasion for pathogen in early infection. Our previous study showed that the surface protein EF-Tu (elongation factor thermo unstable) had stronger ability to combine factor H, the negative feedback regulator of the complement activation pathway. And the expression level of EF-Tu in virulent Mhp strain with stronger colonization ability was significantly higher than that of the attenuated strain, suggesting that EF-Tu may be involved in the Mhp evasion of complement activation guided by factor H. The present study is intended to identify the key binding region of EF-Tu and factor H and verify the relation of the expression of EF-Tu and the inhibition of host complement activation, and elucidate the mechanism of EF-Tu recruiting factor H to evade host complement clearance during Mhp infection.

猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp）感染机体后持续存在，其免疫逃避的机制尚不清楚。能否有效抑制补体旁路途径的激活是感染早期病原免疫逃逸的关键之一。申请人前期研究发现Mhp表面蛋白EF-Tu (elongation factor thermo unstable) 可以结合补体活化的关键负反馈调节组分H因子，且定植能力更强的强毒株EF-Tu表达量更高。提示EF-Tu可能通过劫持H因子介导Mhp的免疫逃避。本申请拟以此为基础，利用分段表达与同源建模分析EF-Tu与H因子的结合方式及关键位点；从体内与体外两个角度，分别比较封闭或高表达EF-Tu的Mhp菌株通过结合H因子对补体活化的影响，明确Mhp的EF-Tu表达量与宿主补体活化的抑制的关联性。解析在Mhp感染中EF-Tu募集H因子逃避宿主补体清除的机理。为Mhp的致病机制及抗感染药物的研发提供理论依据。

支原体能在宿主中持续存在很长时间，表明它们具有免疫逃逸的机制。多种细菌被报道可与补体系统中重要的负反馈调节因子H因子相互作用，从而逃避补体的杀伤，但在支原体中尚未见报道。H因子正常情况下可与宿主细胞结合，从而避免意外的补体激活。而本项目首次发现多种支原体，包括猪肺炎支原体、猪鼻支原体、鸡毒支原体、猪滑液支原体、肺炎支原体、生殖支原体、絮状支原体、牛支原体等也可以结合H因子，将自身伪装成宿主成分，从而摆脱补体的攻击。本项目以猪肺炎支原体为例研究其可能的作用机制，采用免疫蛋白组学的方法，发掘出9个不同的潜在的猪肺炎支原体H因子结合蛋白，包括elongation factor thermo unstable (EF-Tu), P146, pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring) E1 component subunit alpha (PdhA), P46, Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta (PdhB), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)和三个不同的假定蛋白。蛋白互作网络分析显示EF-Tu是其中重要的节点蛋白。另外，强弱毒株比较蛋白组学分析及感染细胞的比较蛋白组学分析发现，EF-Tu在强毒株及感染后会高表达。因此选择EF-Tu为靶点进行进一步的研究。研究发现EF-Tu对H因子的结合可以进一步有助于降低补体C3成分在猪肺炎支原体表面的沉积，并最终阻止进一步的补体激活。实际上，猪肺炎支原体与H因子的结合是具有多功能性的。H因子不仅可以被猪肺炎支原体的EF-Tu蛋白利用来调节补体活性，还可以增加猪肺炎支原体对猪气管上皮细胞的粘附。这是首次关于支原体可以通过与H因子结合而逃避补体杀伤作用的报道，证明了其中的EF-Tu在猪肺炎支原体结合H因子中的重要作用，以及H因子在黏附中的重要作用。同时，不同支原体EF-Tu蛋白序列之间的高度同源性暗示了该机制的普遍性。目前，EF-Tu抗体已被作为一个通用的工具建立了猪支原体的抗原检测方法。另外，在培养基中添加H因子也可以用来改良现有的培养基，提高支原体的滴度，均已申请发明专利。