一种新的Kunitz型蜘蛛多肽的分子改造、表达与生物活性研究

蜘蛛毒液是一个具有多种生物学活性的巨大的药物资源库，但是从天然的毒液中分离纯化和利用化学法合成蜘蛛多肽都很难满足目前的研究和开发利用的需要，而利用基因工程表达是获得蜘蛛多肽的一种有效手段。我们利用生物信息学分析新基因HW11c40所编码的Kunitz型蜘蛛多肽，发现它是具有极强的胰蛋白酶抑制活性和较低的钾离子通道阻断活性。为了证实我们的推测和创制活性专一的胰蛋白酶抑制剂，首先，拟利用PCR定点突变来改造该基因和通过酿酒酵母表达系统来表达该基因及突变体；然后，利用离子交换、反相HPLC和质谱技术来分离、纯化和鉴定它们的表达产物；最后，利用等温滴定量热法等生物动力学与生物热力学方法以及膜片钳和电压钳等电生理技术，对表达产物的胰蛋白酶抑制活性和钾离子通道阻断活性分别进行测定。本项目的顺利实施为创制具有完全自主知识产权的高效的胰蛋白酶抑制剂提供新途径，为治疗急性胰腺炎等疾病提供新型候选药物分子。

本项目克隆和运用生物信息学方法分析了一个包含38个多肽毒素的Kunitz型超家族，在原计划的基础上还增加了三个突变体的分子改造，表达质粒的构建，并进行了酵母表达、色谱纯化和质谱鉴定。在使用酿酒酵母表达系统表达过程中，多次尝试了对表达和纯化的条件进行优化，仍然发现几个突变体表达情况没有达到预期效果。由于表达产物在细菌的周质腔隙内能形成正确的空间构像，我们调整采用pET40b原核表达系统进行表达，分离纯化，Tricine-SDS-PAGE鉴定和质谱鉴定。已成功表达出HWTX-XI，HW11c40及其４个突变体，此系统将为成功表达富含半胱氨酸的多肽毒素提供新的途径。表达产物的功能研究尚在进行中。此外，我们还进行了如下相关方面的研究：（1）通过转录组学和蛋白质组学的比较对虎纹捕鸟蛛毒素组学进行了研究；（2）刺毛虫毒刺cDNA文库的构建及初步分析；（3）单个迷沼狡蛛（Dolomedes mizhoanus）的毒腺转录组学分析，克隆了53个毒素样分子，可以分为6个家族；（4）森林漏斗蛛（Agelena silvatica）毒液和毒腺转录组的研究，克隆了5种毒素分子；（5）克隆和表达多肽DkTx（double-knot toxin）类似物。发表论文5篇,其中SCI论文2篇；项目主持人晋升为副教授和硕士生指导老师以及获得国家留学基金委全额资助公派留学资格并已于2012年9月赴美留学；培养3名已毕业硕士研究生以及多名其他医学生；参加国内外学术会议8次9人次。