新型N-酰基高丝氨酸内酯酶的分子改造、表达及生物活性研究

Biofilm-associated bacteria are highly resistant to antibiotic, which is causing great difficulty in treating bacterial infectious diseases. Quorum sensing (QS) is a communication procedure and can regulate bacterial biofilm formation. N-acyl homoserine lactones (AHLs) are one type of the autoinducers of QS, and they are found in many Gram-negative bacterial pathogens. In contrast to traditional treatment, the disruption of the AHL-mediated quorum sensing mechanisms aims to suppress the expression of virulence rather than to disinfect the organisms. Therefore, AHL-lactonases, which inactivate AHLs by hydrolyzing the lactone bond, are potential to be applied to disrupt quorum sensing and thus control bacterial infections.. In previous study, we obtained a novel gene encoding AHL-lactonase from a metagenomic library and studied the enzymatic properties. It was confirmed that the biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa could be effectively inhibited by the AHL-lactonase. But the thermostability and activity of this enzyme were not very good. In this study, directed evolution and site-directed mutagenesis will be used to reform this AHL-lactonase for improvement of the thermostability and activity. We will also study the effect of the enzyme on the virulence and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa, and obtain the optimum conditions.

近年来，细菌耐药性呈持续增长趋势，对临床治疗构成了严重威胁。大量研究表明，生物膜的形成是细菌耐药性增强的重要因素，其形成过程受群体感应系统调控。革兰氏阴性菌的群体感应主要是由信号分子N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）介导，因此，以AHLs为靶点，通过N-酰基高丝氨酸内酯酶猝灭群体感应信号分子可以抑制生物膜的形成，其作用机理有别于抗生素，不会导致耐药突变株的产生。所以，获得高效N-酰基高丝氨酸内酯酶具有重要的理论意义和应用前景。 . 申请人在前期科研中已克隆到一个N-酰基高丝氨酸内酯酶新基因，并证实其表达产物对铜绿假单胞菌的生物膜形成有较好地抑制作用，但酶的热稳定性和活性有待于进一步提高。本项目拟通过定向进化和定点突变技术对现有基因进行分子改造，以期获得高效降解AHLs且热稳定好的N-酰基高丝氨酸内酯酶，并评估该酶对铜绿假单胞菌毒力及生物膜形成的抑制效果，获得该酶的最适作用条件。

近些年，细菌耐药性呈增长趋势，已对临床构成严重威胁。研究证实，生物膜是细菌耐药性增加的重要因素，其形成过程受群体感应系统调控。革兰氏阴性菌的群体感应主要由N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）介导。因此，以AHLs为靶点，通过N-酰基高丝氨酸内酯酶猝灭群体感应可以抑制生物膜的形成，且其作用机理与抗生素不同，不会导致耐药突变株的产生。故N-酰基高丝氨酸内酯酶是一种具有巨大应用潜力的新型蛋白类药物。 .本人在前期科研中已克隆到一个酯酶新基因，并证实其表达产物对铜绿假单胞菌的生物膜形成有明显抑制作用，但酶的热稳定性较差。本项目在前期工作基础上，通过定向进化和定点突变技术对酯酶基因进行分子改造，通过两步法筛选获得了酶活性和热稳定性都提高的突变酶。.与此同时，我们利用宏基因组学技术从毛豆腐菌丝中克隆到一个酯酶新基因aii810。该基因全长810 bp，编码269个氨基酸，与已报道的酯酶/脂肪酶的氨基酸序列具有中度同源性(25%-85%)。该酶的氨基酸序列已经提交到GenBank，登录号为KY783477。将aii810克隆到表达载体pET-28a (+)上，并在Escherichia coli BL21 (DE3)中实现可溶性表达。酶学性质研究表明，重组酶Aii810的最适反应温度为20 ℃，并在0 ˚С下保留76.5%的酶活性，是已报到的最具冷适应性的N-酰基高丝氨酸内酯酶。该酶在中性及碱性环境或在40 ℃环境下均具有良好的稳定性。在一系列对硝基苯酚酯底物中，该酶的最适底物为对硝基苯酚乙酸酯，其kcat 和Km 值分别为 347.7 S−1 和205.1 μM。此外，Aii810还可以高效水解信号分子C4HSL和3-oxo-C12，降解率分别为72.3%和100%。更重要的是，该重组酶对铜绿假单胞菌毒力因子和生物膜的形成具有强烈的抑制作用。Aii810具有的高效群体感应抑制活性和冷适应性使其在铜绿假单胞菌感染疾病治疗中有很大的应用潜力。本课题的实施有助于缓解病原菌耐药性问题，降低抗生素的使用量及其残留，为疾病防控提供新思路。