NTE相关酯酶调控小鼠脂肪细胞分化和脂肪代谢的机制研究

As a novel lysophospholipase, NRE (neuropathy target esterase-related esterase) may play a role in adipocyte differentiation and triacylglycerol by regulation of lysophospholipid metabolism. On the basis of our previous results, the regulatory machenism of mouse adipocyte differentiation and triacylglycerol metabolism by NTE-related esterase will be studied from the following work: (1) the effect of NRE on cellular lysophospholipid metabolism and adipocyte differentiation using mouse preadipocyte cell 3T3-L1 as cell model by RNA interference and over-expression strategy, on the morphology and number of lipid droplet to uncover the role of NRE in mouse adipocyte differentiation; (2) the regulatory mechanism of NRE in triacylglycerol metabolism in differentiated 3T3-L1 adipocytes and mouse primary culture adipocytes by inhibition and over-expression of NRE to explore the role of cellular lysophospholipid signal pathway in triacylglycerol metabolism; (3) mRNA levels of NRE and its splice variants during adipocyte differentiation and triacylglycerol biosynthesis to reveal the regulatory model of NRE. These results not only are the deep revelation of the novel function of NRE, but also uncover the regulatory mechanism of NRE in mammalian adipocyte differentiation and triacylglycerol metabolism from a new perspective.

神经病靶标酯酶相关酯酶(NTE-related esterase，NRE)作为一种新发现的溶血磷脂酶，可能通过调节溶血磷脂代谢调控脂肪细胞分化和脂肪代谢。本项目拟在前期研究基础上，从3个方面解析NRE调控小鼠脂肪细胞分化和脂肪代谢的机制：（1）以小鼠3T3-L1前脂肪细胞系为细胞模型，采用RNA干涉和超表达策略，研究NRE表达对细胞溶血磷脂和细胞分化的影响，检测脂滴形态和数量变化，揭示NRE在小鼠脂肪细胞分化中的作用；（2）以分化的3T3-L1脂肪细胞和小鼠原代培养的脂肪细胞为模型，通过抑制和增强NRE的表达，研究溶血磷脂信号通路调控脂肪代谢，阐明NRE在脂肪代谢调控中的作用机制；（3）检测NRE及其转录剪接变异体在脂肪细胞分化和脂肪生成过程的mRNA表达水平，确定其中NRE的调控方式。这些结果不仅是对NRE新功能的深入认识，而且必将从新的角度揭示哺乳动物脂肪细胞分化和脂肪代谢的调控机制。

NTE相关酯酶（NTE-related esterase,NRE)不仅是内质网膜上的溶血磷脂酶，而且还能与脂滴（lipid droplet, LD）共定位。然而目前尚不清楚NRE的蛋白结构域在其靶定脂滴中的作用及其在前脂肪细胞分化和脂代谢中的作用。本项目：（1）利用GFP标记的NRE及其短截体，采用激光共聚焦显微观察，检测它们与脂滴的共定位，以确定NRE结合脂滴所必需的蛋白结构域。结果发现表明跨膜结构域在NRE与脂滴的结合中起着非常重要的作用，并且NRE在脂滴形成的过程中与脂滴结合更明显。这些结果提示NRE很可能通过调节膜中溶血磷脂调控脂滴的发生形成，在脂滴早期发生和融合增大中起重要作用。（2）建立了小鼠前脂肪细胞3T3-L1分化为脂肪细胞体系，采用RNA干涉技术抑制小鼠前脂肪细胞中NRE的表达，比较正常和NRE表达降低的细胞分化。结果表明降低NRE的表达抑制前脂肪细胞的分化。（3）以分化的脂肪细胞为模型，胰岛素诱导脂肪细胞脂肪合成，RNA干涉抑制NRE的表达，发现NRE表达抑制后，降低了脂肪细胞内甘油三酯的水平。这些结果初步揭示了NRE调节脂肪细胞分化和脂肪代谢的作用，并确定了NRE的结构域与其脂滴定位的关系，提示NRE可能在脂肪答谢和脂滴生成中起一定作用。. 近年来，哺乳动物中含patatin 样结构域磷脂酶（patatin-like domain containing phospholipases，PNPLA）因在脂代谢和信号转导中发挥重要作用，日益受到广泛关注。然而迄今为止对于PNPLA1的认识知之甚少。本研究首先克隆了人PNPLA1的 全长编码cDNA序列，其编码532个氨基酸，具有完整的patatin结构域。组织表达分析表明除了在消化系统、骨髓和脾组织表达较高外，PNPLA1在其他组织表达都非常低。用绿色荧光蛋白标记的人PNPLA1主要分布在细胞质中定位于脂滴上。进一步在宫颈癌细胞中鉴定了一个PNPLA1的无义突变体，此突变体编码412个氨基酸，缺少C-末端结构域，并且不能与脂滴共定位，这表明PNPLA1的C-末端区域是其结合脂滴的必需结构。这些结果首次鉴定了人PNPLA1，并发现了宫颈癌细胞PNPLA1的突变体，为进一步揭示其结构和功能关系提供了线索。