生长素响应因子ARF对山核桃嫁接成活的调控机理研究

生长素响应因子ARF作为调控生长素响应基因表达的转录因子，在生长素信号传导途径中起到十分关键的作用。申请人利用cDNA-AFLP技术在山核桃嫁接成活过程中克隆到一个生长素响应因子，初步证明了该基因对山核桃嫁接成活起到基因表达调控的作用。本项目拟通过克隆山核桃生长素响应因子ARF基因全长和启动子序列，利用定量RT-PCR、Western杂交和mRNA原位分析等方法对山核桃生长素响应因子进行表达特性和功能研究，来阐明这一基因对山核桃嫁接成活的调控机理及其与维管束桥形成的相互关系，不仅丰富了生长素响应因子基因家族的基因信息，为生长素响应因子蛋白的研究提供了良好的物质基础，而且有助于揭示ARF影响山核桃嫁接成活的作用机制和山核桃嫁接过程生长素信号传导机制，为山核桃等木本植物园艺化栽培提供一定的理论基础。

生长素是一类与植物生长发育相关的重要植物激素，它影响维管束的发育、胚胎中轴的建立、侧生器官的形成、叶序排列、向光反应以及根部向地性等。生长素响应因子ARF在调控生长素响应基因表达起到重要的转录因子功能。本项目采用定量RT-PCR、Western杂交、免疫金定位等方法对山核桃CcARF进行功能研究，结果表明：1.克隆得到的CcARF cDNA全长2337个碱基，该基因与其他植物ARF基因同源性较高。系统进化树表明CcARF与蓖麻基因的亲缘关系最近，葡萄基因次之，与杨树的亲缘关系较远。2．在接穗中，山核桃CcARF基因的表达量在嫁接早期急剧下降，随后上升明显，然后下降。在砧木中，嫁接早期该基因表达量急剧下降，随后上升明显。与对照相比，IAA处理的山核桃CcARF基因的表达量明显升高，而NPA处理的山核桃CcARF基因的表达量明显降低。3．山核桃嫁接过程中，CcARF蛋白的表达量是不相同的。在对照组中，山核桃CcARF蛋白的表达量在嫁接整个过程中都比较低。用IAA处理，山核桃CcARF蛋白的表达量在嫁接整个过程中都比较高，尤其是在接穗中表达量更高。但用IAA抑制剂NPA处理，山核桃CcARF蛋白的表达在嫁接整个过程中明显受到抑制。4．在山核桃嫁接过程中，山核桃IAA氧化酶的活性总体呈现逐渐上升趋势。通过IAA处理，在嫁接早期接穗的IAA氧化酶的活性明显下降。通过NPA处理明显提高了IAA氧化酶的活性。5．山核桃嫁接面愈伤组织细胞IAA的免疫反应特异性强，金颗粒主要集中在砧穗质体的淀粉粒上。IAA在愈伤组织和维管组织的形成和分化过程中具有十分重要的作用。以上为进一步从生长素运输和响应相关的基因在山核桃嫁接成活过程的功能进行系统研究提供理论和应用基础。