Aux/IAA在山核桃嫁接成活过程中的作用机理研究

Aux/IAA gene plays an essential role in phytohormone auxin signal transduction and plant growth and development as one of the early auxin response genes. An Aux/IAA in hickory (Carya cathayensis) during graft process was cloned using cDNA-AFLP. We found that Aux/IAA play a role of gene expression and regulation during graft process. In this project, we will use the molecular biology and immuno-gold technique to observe the effect of Aux/IAA on grafting, illustrate the role of this gene on the combined effect of rootstock-scion and clarify its relationship with the formation of vascular bridge from three levels of whole - tissue - cells. It will not only enlarge the information of the Aux/IAA gene family and provide a basis for Aux/IAA research, but also benefit to uncover the mechanism of auxin across the membrane and the function of Aux/IAA in hickory during graft process, and provide a theoretical basis for horticulture cultivation of hickory and other woody plants.

Aux/IAA 基因作为生长素早期诱导表达的基因，在生长素信号传导和植物的生长发育中起到十分重要的作用。申请人利用克隆到一个山核桃Aux/IAA 同源基因，并初步证明了该基因可能对山核桃嫁接成活起到基因表达调控的作用。本项目拟通过克隆Aux/IAA 基因全长和启动子序列，利用定量RT-PCR、Western 杂交和免疫胶体金定位技术等方法对山核桃Aux/IAA 进行表达特性和功能研究，来阐明这一基因对山核桃嫁接成活的调控机理及其与维管束桥形成的相互关系，不仅丰富了Aux/IAA 基因家族的基因信息，为Aux/IAA 的研究提供了良好的物质基础，而且有助于揭示Aux/IAA 影响山核桃嫁接成活的作用机制和山核桃嫁接过程生长素信号传导机制，为山核桃等木本植物园艺化栽培提供一定的理论基础。

山核桃（Carya cathayensis Sarg.）是我国特有的木本油料树种。嫁接是解决山核桃园艺化、良种化栽培的重要手段。生长素对嫁接成活过程起关键调控作用。利用RACE、荧光定量PCR、Western杂交等技术对山核桃Aux/IAA基因在嫁接成活过程中的表达特性及功能进行研究。克隆得到山核桃Aux/IAA候选基因CDS序列，该基因ORF长度为591bp，编码196个氨基酸，其编码蛋白为亲水性非跨膜蛋白，与其他物种Aux/IAA基因编码蛋白具有高度同源性。检测了CcIAA基因在山核桃嫁接后不同时间和不同处理下的转录水平表达变化，发现在嫁接后0~7天内，基因的表达量显著降低，嫁接后14天基因表达量显著升高并高于嫁接前。IAA处理组该基因的表达量整体高于对照组，NPA处理组该基因的表达量整体低于对照组。检测了CcIAA基因在山核桃嫁接后不同时间和不同处理下的翻译水平表达变化，发现嫁接0~3天，Aux/IAA蛋白在翻译水平的表达量较少，嫁接后7天开始蛋白表达量上升，嫁接后14天蛋白表达量达最大值。山核桃嫁接后，随着时间的延长，Aux/IAA基因在转录和翻译水平的表达量变化趋势基本一致。在维管束桥形成相关基因中，除AHA3基因外，CesA3、IRX5和HB8基因在嫁接后3天和7天基本呈下调表达趋势，嫁接后14天基因表达量升高，达到或超过嫁接前水平。在嫁接后的特定时期，IAA处理组中CesA3、AHA3和HB8基因的表达量显著高于对照组。基于高通量测序结果，克隆到22个山核桃Aux/IAA基因CDS序列，其编码蛋白包含全部或部分Aux/IAA家族的4个保守结构域；CcIAAs在8个进化亚组中呈现不均匀分布；大部分CcIAAs均呈现组织特异性表达，CcIAA11、CcIAA27a1、CcIAA27a2和CcIAAx在茎部表达明显。22个CcIAAs在山核桃嫁接成活过程中作用不同，其中19个CcIAAs在山核桃嫁接成活过程中下调表达，3个上调表达。嫁接相关CcIAAs编码蛋白定位在细胞核。对山核桃嫁接成活过程进行转录组和蛋白质组测序，共鉴定到850个差异表达基因和710个差异表达蛋白，其中生长素信号通路相关基因和生长素相关蛋白在山核桃嫁接过程中发生了显著的表达变化，证实了生长素对山核桃嫁接过程的调控作用。