microRNA调控未成熟树突状细胞活化的机制研究及其在小肠移植免疫耐受中的作用

如何获得稳定表型、不易成熟的未成熟树突状细胞（imDC）是imDC诱导免疫耐受的关键，目前尚缺乏鉴定DC成熟状态的特异性分子标志物，而且imDC极易在体内活化成熟。最近研究发现microRNA对免疫细胞分化、免疫应答等具有重要调控作用，基于Toll样受体（TLR）信号在imDC成熟活化中的关键作用，我们设想TLR信号介导转录miRNA在imDC成熟活化过程中可能发挥重要的调控作用。本项目拟在前期imDC诱导小肠移植免疫耐受研究基础上，应用microRNA芯片技术筛选、鉴定imDC成熟活化的关键microRNA，以期作为鉴定DC未成熟/成熟表型的新的分子标志物；运用生物信息学、EMSA和ChIP等进一步研究TLR信号介导转录microRNA在imDC活化过程中的作用及调控机制，阐明microRNA调控imDC成熟活化机制,有望为制备具有稳定表型的imDC诱导免疫耐受等提供新的思路。

研究树突状细胞（DC）成熟过程中microRNA表达谱的变化，筛选鉴定出对DC成熟过程起关键调控作用的microRNA。 ..将大鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞（imDC）用脂多糖 (LPS) 刺激成熟。分别于0h, 12h, 24h后提取总RNA，进行microRNA芯片杂交，应用生物信息学方法进行miRNA表达谱数据分析,寻找预测可能对DC成熟过程起关键调控作用的microRNA。.与未受LPS刺激的imDC比较，刺激12h之后的DC有54种microRNA的表达出现显著改变，其中44种microRNA表达下调2倍以上，10种表达上调2倍以上；与LPS刺激12h的imDC比较，刺激24h之后的DC有76种microRNA的表达出现显著改变，其中32种microRNA表达下调2倍以上，44种表达上调2倍以上；与未受LPS刺激的imDC比较，刺激24h之后的DC有92种microRNA的表达出现显著改变，其中52种microRNA表达下调2倍以上，40种表达上调2倍以上。选取19个表达显著变化的microRNA做进一步靶基因的预测，从预测结果中挑选出同时被3个microRNA同时作用的靶基因，共4个（WEE1、CHKA、CDC37L1、RGD1359108）。.用CD11c磁珠阳性分选的小鼠imDC，imDC用LPS刺激24小时前后用qRT-PCR检测miRNA的变化。在LPS刺激后miR-27a，miR-27b，miR-451出现明显的下降。 imDC分别转染miR-27a，miR-27b，miR-451的mimics来过表达这3个microRNA。6小时后以LPS刺激转染后的imDC，流式细胞仪检测显示：转染miR-27a的mimics的imDC出现了表型成熟受到抑制的现象。提示 miR-27a可能是影响imDC成熟的重要的microRNA。运用数据库逐一预测miR-27a靶基因，取三数据库预测结果的重叠部分作为候选靶基因。运用KEGG PATHWAY Database 筛选出靶基因预测结果中在TLR信号通路中发挥作用的的MAP2K4基因，提示miR-27a可能作用于MAP2K4这个基因通过TLR信号通路中发挥其抑制LPS诱导的骨髓来源imDC (BMDC) 的表型成熟以及其功能的改变。