昆那霉素生物合成独特后修饰反应的研究

Kinamycins represent a series of atypical angucycline compounds produced by Streptomyces murayamaensis and Streptomyces ambofaciens, which contain unique post-PKS modifications including the formation of a five-membered B ring, a highly hydroxylated and acetylated A ring and a diazo group on the B ring. Atypical angucyclines are biosynthesized from benz[b]anthracene intermediates via oxidative ring-opening and rearrangement reactions. Four types of atypical angucyclines could be formed due to different post ring-opening and rearrangement reactions, thus these reactions are critical for the structural diversity of atypical angucyclines. Hydroxylation of A ring is uncommon in atypical angucyclines. Diazo group is rare in natural products, nothing is known about its biosynthesis. In this study, we will characterize the unique post-PKS tailoring reactions in kinamycin biosynthesis using the producer S. ambofaciens. These reactions will be studied by in vivo gene knock-out, heterologous gene expression and bioconversion experiments, the key enzymes will be further characterized by in vitro enzymatic assay and crystallography. Fast separation and identification techniques such as LC-MS will be used to analyze reaction intermediates or products. The insights gained from these studies will not only be helpful for our understanding about the biosynthesis of antibiotics, but also offer enzymes with novel functions for synthetic biology and enzyme-catalyzed organic synthesis.

昆那霉素（kinamycin）属于非典型角蒽环聚酮化合物。研究表明目前已知的四类非典型角蒽环化合物均是从苯并蒽类中间体出发，经过复杂的氧化开环和重排反应合成。氧化开环及重排反应是此类化合物发生结构分化的关键节点。昆那霉素A环氧化和乙酰化以及B环重氮修饰在已知聚酮化合物中很少见，其生物合成过程也不清楚。本项目以Streptomyces ambofaciens中昆那霉素合成基因簇alp为研究对象，对其生物合成过程中的特殊后修饰反应展开研究，通过体内基因敲除、异源表达及生物转化、蛋白表达纯化、晶体结构及体外活性研究，深入剖析氧化开环的反应机制以及决定产物结构的关键因素，鉴定参与A环修饰及重氮基团形成的关键酶，以期阐明昆那霉素的生物合成途径。对这些特殊后修饰反应进行深入研究，不仅有助于我们理解天然产物的合成机理，也为合成生物学与酶催化有机合成提供新的工具，具有重要理论意义和潜在应用价值。

醌那霉素（kinamycin）与lomaiviticin等化合物具有相似的结构特征，如：苯并[b]芴骨架、高度氧化修饰的A环等，但是其生物合成机制此前尚不明确。本项目研究针对参与醌那霉素生物合成过程的关键酶进行催化功能研究。我们首先通过生物信息学分析，拓展了原有Streptomyces ambofaciens中醌那霉素生物合成基因簇的范围。证实加氧酶AlpJ催化dehydrorabelomycin发生氧化开环和重排反应，生成苯并[b]芴骨架中间体及其二聚体，反应需要FADH2提供还原力；FAD依赖的加氧酶AlpK可以为AlpJ催化的反应提供还原力，并且AlpK可能引导氧化开环产物向后续的生物合成步骤转移。我们还与生物物理所刘志杰研究组合作，解析了AlpJ的晶体结构，鉴定了参与底物结合与催化的关键残基。这些研究结果对于进一步深入研究氧化开环酶的催化机理以及决定产物结构类型的关键因素奠定了基础。我们通过生物信息学分析，推测了可能参与醌那霉素A环修饰过程的酶，并证实其中Alp1U为环氧化物水解酶，同时证实lomaiviticin合成基因簇内对应的Lom6也为环氧化物水解酶。二者都能催化epoxykinamycin的环氧水解反应生成kinamycin F，Alp1U还可以催化带乙酰基修饰的epoxykinamycin FL-120B’发生环氧水解反应生成kinamycin E。该研究直接说明了在醌那霉素与lomaiviticin生物合成途径中都存在相同的A环环氧化物中间体和水解后的A环四羟基中间体，以及相应的环氧化物水解酶，进而推论出醌那霉素与lomaiviticin共享相同的A环变形新机制。这对于阐明lomaiviticin二聚化的合成机理有指导意义。