FOXP2基因对神经嵴干细胞分化潜能的调控作用

神经母细胞瘤（NB）是最常见的小儿恶性实体肿瘤之一，与胚胎期神经嵴干细胞（NC）发育分化形成交感神经节受阻有关，但机制不明。本课题组前期研究发现胚胎发育调控基因FOXP2在NB患者中高发变异，并已建立NB病人特异角化细胞系。本实验拟通过基因转染逆向诱导角化细胞返祖形成诱导性多能干细胞后再定向诱导分化生成NC，运用RNA干扰技术、荧光定量PCR、免疫印迹、免疫荧光等技术及激光共聚焦显微镜检测分析FOXP2基因不同表达水平对NC细胞分化形成外周交感神经系统神经元及神经胶质细胞的影响；运用全基因组表达芯片技术检测分析FOXP2调控NC细胞分化潜能的信号转导通路网络调控机制。如达到预期目标，本课题将阐明NB细胞分化阻滞机制，揭示NB发生的始动机制，为NB的早期诊断及临床分子靶向诱导分化治疗提供理论依据。

神经母细胞瘤（NB）是最常见的小儿恶性实体肿瘤之一,与胚胎期神经嵴干细胞发育分化形成交感神经节受阻有关，但机制不明。课题组前期研究发现胚胎发育调控基因FOXP2在神经母细胞瘤患者中高发变异。本项目进一步研究FOXP2基因对神经嵴细胞向外周交感神经元分化的影响及相关机制。首先，通过提取人脂肪干细胞成功将人脂肪干细胞逆向诱导形成多能干细胞（hIPS），并应用体外细胞试验再诱导IPS分化形成神经嵴细胞及外周交感神经元，建立干细胞向神经嵴细胞及外周交感神经元分化的体外细胞实验模型。其次，运用MLPA，荧光定量PCR及western blot等检测FOXP2基因在NB来源与非NB来源神经嵴细胞，NB肿瘤组织与瘤旁组织中的表达变化。发现肿瘤组织及NB来源神经嵴细胞中FOXP2基因拷贝数较瘤旁组织及非NB来源神经嵴细胞异常增高，mRNA及蛋白水平表达明显升高（p < 0.05）。同时，荧光定量PCR及western blot等方法观察FOXP2基因表达变化对神经嵴细胞向外周交感神经元分化的影响，发现FOXP2高表达组诱导分化后细胞中外周交感神经元特异性标记物peripherin 、β-tubulin mRNA及蛋白水平表达较FOXP2低表达及正常表达组明显降低（p<0.05)，而神经嵴细胞特异性标记物p75、Hnk1 mRNA及蛋白水平表达较其他两组明显升高（p<0.05)，FOXP2低表达与正常表达组表达无明显差异（p>0.05)。此外，进一步应用Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G全基因组表达谱芯片分析筛选出两组神经嵴细胞差异性表达的基因。实验结果发现FOXP2共有77个基因出现差异表达，其中AKAP9等14个基因差异表达量显著。基因功能分析显示差异表达基因具有传导细胞间信号，调控组织器官生长发育，基因转录后修饰及蛋白修饰等功能，参与编码ILK等经典信号通路中关键蛋白。差异表达基因之间也存在相互作用，在神经性疾病，器官损伤或畸形，DNA损伤修复机制异常及肿瘤和信号传导方面发挥主要作用。通过本项目研究，建立了NB发生相关机制研究的体外细胞模型，证实了FOXP2对神经嵴细胞分化为外周交感神经元的影响，并初步阐明了相关的分子机制，提示FOXP2基因变异或表达异常在NB发生中扮演了重要角色。