基于限定性构象策略的呋喃它酮代谢物半抗原定向设计及其免疫原性增效分子基础

Immunoassay with directness, rapidity and accuracy is now the research hotspots in the field of determination of food chemical contaminants. However, the existence of flexible structure in the haptens always resulted in the poor affinity or specificity of obtained antibody. The design of constrained hapten conformation can solve this problem. In this project, the furaltadone metabolite AMOZ is selected as a model to design a series of haptens with constrained conformation and to produce antibodies with high affinity and specificity directly to AMOZ. Molecular modeling is assisted to design haptens against AMOZ, and dendrimers are used as novel carrier to study their effects on producing antibody with higher affinity. Animal are immunized with the dendrimers immunogens and antiserum are obtained and characterized for their antigen binding ability. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescence spectrum, electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) and isothermal titration calorimetry (ITC) are used to study the interaction of antibody and AMOZ as well as its haptens. The interaction mechanism between antibody and AMOZ as well as its haptens are finally clarified. The direct and rapid immunoassay for AMOZ would be finally developed. The results of this study should make a foundation for the producing of antibody with better affinity and specificity. No similar reports regarding on the content of this project are found.

直接、快速、准确的免疫检测技术是目前食品化学有害物检测领域的研究热点。但是多数小分子内存在的柔性结构是导致其高亲和力特异性抗体困难的技术瓶颈。构象限定性半抗原策略是突破该技术瓶颈的关键。本项目以呋喃它酮代谢物AMOZ为模型对象，采用计算机模拟辅助手段分析设计不同类型的构型限制性半抗原，同时结合树状分子载体的免疫增敏优势，通过动物免疫，制备抗血清，鉴定其抗原识别活性；采用酶联免疫吸附分析、荧光光谱、软电离质谱、等温滴定微量热等手段对抗体与AMOZ及其半抗原识别的特性与构效关系进行实验和模拟分析，探讨特异性抗体与AMOZ及各构象限定性免疫半抗原的相互作用机制，最终建立直接检测AMOZ的免疫分析方法。本研究不但为创新小分子药物抗体制备方法奠定基础，而且为丰富小分子有机物免疫检测技术手段提供新的依据。AMOZ构象限定性免疫增敏半抗原设计及其直接免疫分析法未见报道。

本项目以畜禽产品中违禁呋喃它酮的代谢物AMOZ为对象，针对其分子量小、柔性大，造成非衍生直接识别AMOZ的抗体制备困难问题，采用半抗原构象限定性分子结构策略，探讨小分子半抗原构象限定性结构特异性免疫应答增效的分子基础与构效关系规律，取得的主要结果如下：（1）设计合成了系列构象限定性AMOZ结构类似物半抗原/抗原，并进行了动物免疫和抗血清识别特性鉴定，结果表明五六元环间羰基碳桥及其偶联手臂亚胺双键与芳香性呋喃环组合的半抗原分子结构能够明显增强AMOZ特异性识别的免疫应答效应；（2）以抗原递呈过程中的产生免疫应答第二信号的决定性关键蛋白——主要组织相容性复合体MHC II为关键出发点，建立了半抗原-提呈抗原肽-MHCII免疫提呈复合物的3D空间识别模型，结合抗血清免疫识别活性，探讨了构象限定性策略增效的分子结构基础与构效关系规律，结果表明：免疫应答活性主要取决于分子骨架的相似度、骨架刚性及其与MHCII复合后向MHCII抗原肽结合沟槽表面外沿伸展暴露程度及暴露特征结构的表面构象稳定性等几个关键结构因素，整体取决于半抗原在MHCII表面的构象限定与暴露程度。而充分的构象稳定与暴露有利于被提呈结合于细胞表面受体，有利于稳定诱发关键的免疫应答第二信号，从而促使特异性抗体的稳定产生；（3）优选制备了特异性识别AMOZ的单克隆抗体，并建立了无需衍生化的免疫检测方法，IC50为10.61ng/mL，检测限达0.71ng/mL，适用于AMOZ直接无衍生快速检测；（4）发表论文14篇，其中SCI论文8篇，EI论文2篇；申请发明专利5件，其中已授权2件；（5）项目组3名在职成员晋升高级职称，1名成员入选珠江学者人才项目，培养博士毕业生1名，硕士毕业生6名，在读博士和硕士研究生各1名。本项目明确了半抗原骨架与偶联手臂结构适当的构象限定性改造对于特异性免疫应答具有显著增效作用；同时，提出基于免疫应答提呈关键蛋白MHCII的半抗原-递呈抗原肽-MHCII复合物三维空间结构模型，可实现高特异免疫原性半抗原定向设计目的，对于指导其他小分子特异性抗体的制备及提高抗体分析识别性能，具有重要的科学指导意义。