沙门氏菌毒素效应蛋白SifA C-端结构域毒力功能机制的研究

The virulence of the intracellular pathogen Salmonella relies on the expression of bacterial virulence effector proteins. Such as SifA that plays significant role in Salmonella virulence. SifA is made of two distinct domains. The virulence of SifA N-term domain depends on its interaction with the host protein SKIP. However, the host protein targeted by SifA C-term and the molecular mechanism of this domain in virulence are still not known. The SifA C-term has a fold similar to other bacterial effector proteins having a guanine nucleotide exchange factor (GEF) activity. During my previous study, we characterized the SKIP-independent role of SifA C-term in virulence and observed a similar role between SifA C-term and a host GTPase protein Arl8b in recruitment of lysosomal glycoproteins. Therefore, we propose that SifA C-term could interact and activate Arl8b during infection. In this project, we will characterize the interaction between SifA C-term and the host protein Arl8b by biochemical analysis, and the nucleotide activity of SifA C-term to Arl8b by an in vitro fluorescent GEF assay. In addition, taking the advantage of the siRNA and gene knock-out mouse technique, we will verify the role of SifA C-term in virulence in the absence of Arl8b. Altogether, this study will elucidate the role of SifA C-term in pathogenic process and obtain a complete knowledge of the signaling pathway(s) controlled by this two domains protein, which cloud be very important information for the prevention and treatment of Salmonellosis.

毒素效应蛋白是细胞内寄生型沙门氏菌发挥毒力的重要武器。SifA是这类蛋白中的一员，对沙门氏菌在宿主细胞内的命运至关重要。SifA由N-端和C-端两个结构域组成。SifA N-端的毒力依赖于其与宿主蛋白SKIP的结合，但其C-端功能机制尚未明确。申请人前期工作发现SifA C-端具有非依赖于SKIP的毒力功能，且SifA C-端与宿主蛋白Arl8b对核糖体糖蛋白具有相似的调控作用。因此我们推测：SifA C-端的毒力功能依赖于其与Arl8b的结合且对Arl8b具有活化作用。本项目将利用分子生物学、生物化学、细胞生物学、小鼠遗传学等手段，鉴定SifA C-端的潜在受体蛋白Arl8b；检测SifA C-端对Arl8b的核苷酸转化活性并构建Arl8b缺失表达环境对SifA C-端毒力功能机制进行深入研究，以期验证前期推断进而揭示SifA C-端的毒力调控分子机理，这对沙门氏菌病的防治具有重大意义。

SifA是沙门氏菌III型分泌系统（T3SS）分泌和转运的一种毒素效应蛋白，对该病原菌的毒力至关重要。SifA的晶体结构表明其有N端和C端两个结构域。SifA的N端结构域与宿主蛋白SKIP（SifA-Kinesin-Interacting-Protein）相互作用，是该病原在感染的细胞内形成沙门氏菌囊泡（SCV）和诱导细丝（Sifs）的前提，同时SifA N-端的毒力功能依赖SKIP。项目主持人攻读博士学位期间的研究结果证实，SifA C-端介导了一种与SKIP无关的毒力功能。SifA C-端与宿主蛋白GTPase家族成员Arl8b，二者在沙门氏菌感染细胞内都具有向Sifs招募溶酶体糖蛋白LAMP1（LGPs）的作用。SifA C-端结构域的特殊折叠结构提示其可能作为一种鸟苷酸转运因子（GEF，Guanine nucleotide Exchange Factor）。然而，SifA C-端是否可以活化Arl8b以及SifA C-端的毒力是否依赖于Arl8b目前尚不清楚。基于此，课题中利用基因重组技术对SifA和Arl8b进行了原核表达及纯化，并进一步借助体外荧光GEF活性测定方法研究了SifA对 Arl8b的活化作用。同时利用CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术，建立了内源性Arl8b缺失表达的Raw264.7细胞和Arl8b基因敲除C57BL/6小鼠模型，对SifA C-端的毒力功能与Arl8b的关系进行了研究。数据显示，体外荧光GEF活性测定结果显示SifA对Arl8b并不存在活化作用。在Arl8b缺失表达的Raw264.7细胞及Arl8b基因敲除C57BL/6小鼠的巨噬细胞中，sifAL130D的增值能力与∆sifA突变株相当。作为对照，sifAL130D在野生型Raw264.7细胞和野生型C57BL/6小鼠巨噬细胞中的增值水平均高于∆sifA突变体。此外，对sifAL130D和∆sifA突变株在小鼠感染模型中的毒力水平测定结果发现，在C57BL/6小鼠中sifAL130D的毒力明显强于∆sifA（CI为0.61±0.22），而在Arl8b-/-小鼠中二者的毒力水平相似（CI为1.14±0.39）。证实Arl8b是SifA C-端结构域在沙门氏菌胞内复制中发挥作用的重要介质，并且Arl8b对SifA C-端的毒力是必不可少的。