猴B病毒囊膜蛋白gB和gD抗原表位鉴定及其在膜融合过程中的功能研究

B病毒以猴为自然宿主，具有感染率高、终生潜伏、无明显临床症状等特点；人感染B病毒的死亡率超过70%。我们前期发现，B病毒囊膜蛋白gB和gD抗血清对病毒有中和作用，但中和表位组成及作用途径尚不清楚。鉴于B病毒与HSV等α疱疹病毒高度同源，我们假设其感染关键环节- - 膜融合也是由gD和/或gB启动，并在gL和gH共同参与下完成。为此，我们首先构建gB和gD胞外区基因葡萄球菌展示肽库，以多克隆抗体进行流式细胞分选，鉴定其抗原表位。其次，合成表位肽，以ELISA和病毒培养初步筛选中和表位及优势表位，进而利用肽展示菌分离单一抗体，以中和实验确定中和表位及优势表位。最后，构建表位缺失突变体，一方面通过ELISA检测突变蛋白与细胞的相互作用；另一方面与其他膜蛋白共转染CHO-K1，并与Vero细胞进行细胞融合，通过合胞体形成、免疫共沉淀研究其功能。本研究旨在阐明gB和gD在B病毒感染过程中的作用和机制。

B病毒是以猴为自然宿主的人兽共患病，对人的致死性高，是实验猴质量控制的重要病原。当前，由于B病毒预防和治疗手段缺乏，抗体检测及种群净化是主要防控策略。鉴于gD和gB蛋白在病毒感染中的重要作用以及作为机体免疫应答的主要靶分子，本课题提出gD和gB的抗原表位及在膜融合中的作用研究，目的是建立B病毒抗体检测的快速准确方法，解决我国实验猴在B病毒检测中与国际金标准的明显差距；同时阐明B病毒早期感染的分子机制，为疾病防控提供新靶点。结果如下：.（1）B病毒流行病学调查：采集猴血清、三叉神经节和腰骶神经节，先检测血清中B病毒抗体，然后再进行PCR诊断。结果发现，B病毒抗体阳性动物中，约三分之一为PCR阳性（30.8%，4/13），且PCR结果均出现于三叉神经。另外，gL基因的GC含量明显低于gD（64.1% VS 74.2%），扩增效果优于gD，更适合作为分子检测靶标。. （2）B病毒抗体检测试剂研制及应用：分别利用大肠杆菌和CHO细胞制备B病毒gB和gD重组蛋白，研制抗体检测试剂。实验发现，原核表达产物的敏感性及稳定性均低于真核表达产物；单一重组蛋白都可能造成部分阳性血清漏检；联合使用真核表达的gB和gD蛋白，检测结果与国际金标准吻合率在98%以上，是目前国内最好的检测制剂。.将试剂盒送四川宜宾横竖生物公司测试，结果与标准的吻合率为97.5%（272/279），公司同意采购本制剂。. （3）gD和gB表位研究：利用生物信息学预测gD蛋白抗原表位，再用阳性血清进行验证。在预测的7个表位中，4个肽段（46~54、106~116、291~306和361~370）与阳性血清发生反应（即表位），但前3个肽段的敏感性都低于后者（文献已证实）。在此期间，文献报道了gB的表位研究结果，故未开展相关工作。. （4）gD和gB在膜融合中的作用研究：将B病毒gB、gD、gH和gL基因以不同组合共表达于细胞上，再与不同细胞混合并观察细胞融合。结果发现：细胞融合需要4种病毒分子共同参与；nectin-1是病毒的受体分子；gD在细胞融合中发挥重要作用，缺失突变体gD-△53-62和gD-△239-258 导致细胞融合消失，gD-△154-162使细胞融合减少，而gD-△221-225对细胞融合无影响；但4个缺失部位肽段都不是表位。