小G蛋白在甲型流感病毒囊膜蛋白转运过程中的功能研究

Small GTPases, the GTP-binding proteins (G proteins), are ubiquitously expressed in eukaryotes. It has been shown that small GTPases play important roles in a variety of cellular processes, including maintaining the cell polarity, cell-cell interaction, cell proliferation and apoptosis, vesicular transport, and protein trafficking. However, the roles of small GTPases in the intracellular transport of viral proteins are not fully understood. Based on our preliminary study, in this project we will investigate the involvement of Rho GTPase family members RhoA, Rac1 and Cdc42 in intracellular transport of three membrane proteins of influenza A virus--neuraminidase (NA), hemagglutinin (HA) and matrix protein 2 (M2). First, we will determine whether RhoA, Rac1 and Cdc42 play roles in the intracellular transport of HA and M2 to host cell surface. To this end, we will perform the experiments using specific inhibitors, Rho GTPase knockdown/overexpression and biotin labeling system. Second, we will identify the functional domain of NA that is important in its intracellular trafficking by constructing a series of truncated mutants; Finally, we will address the mechanism of how these Rho GTPases influence the protein trafficking of NA, HA and M2 in host cells. Together, these studies will contribute to better understanding of the regulation network of influenza virus infection and replication.

小G蛋白（small GTPases）是广泛存在于真核细胞内的一种GTP结合蛋白。小G蛋白主要参与调控细胞极性、细胞间相互作用、细胞增殖和凋亡、囊泡运输与蛋白转运等重要生理过程。然而，它们在病毒蛋白转运过程中的功能仍不完全清楚。本项目在前期工作的基础上，研究Rho家族的小G蛋白（RhoA、Rac1及Cdc42）在甲型流感病毒囊膜蛋白--神经氨酸酶（NA）、血凝素（HA）、基质蛋白2（M2）转运过程中的作用。首先，采用特异性抑制剂、干扰小G蛋白（RhoA、Rac1或Cdc42）、过表达这些小G蛋白的野生型、活化型或功能缺失突变体，研究这些Rho家族成员是否参与HA和M2在宿主细胞内的转运过程；其次，构建缺失不同部位的NA截短体，研究NA在转运过程中发挥关键作用的功能区；最后，深入探讨Rho蛋白影响NA、HA及M2转运的机理。这些研究将为全面揭示甲型流感病毒感染与复制的调控机制提供新证据。

本实验室的前期研究工作已经发现Cdc42能够促进流感病毒NA蛋白向宿主细胞膜表面转运。本项目通过进一步研究表明NA氨基端特定位点的氨基酸序列（7-15位）会影响NA蛋白的转运过程，而且Cdc42不能促进这些NA突变体转运至细胞膜表面，说明NA蛋白氨基端的这段氨基酸序列对于NA的胞内转运非常重要。另外，通过筛选发现小G蛋白Rab11同样参与了流感病毒NA蛋白的胞内转运过程。共转Rab11 野生型质粒的293T细胞与共转空载体的对照细胞相比，其细胞表面NA蛋白的酶活明显增强。与NA蛋白类似，HA蛋白是流感病毒囊膜表面另一个非常重要的膜蛋白。在研究中，我们发现破坏HA表达可以明显改善病毒感染引起的病症。我们采用RNA干扰技术构建了可以稳定表达靶向HA的shRNA转基因小鼠，该小鼠对流感病毒具有明显的抵抗能力。最近，我们发现小G蛋白Cdc42会影响流感病毒感染引起的自噬，持续活化的Cdc42可明显降低自噬标记蛋白LC3-Ⅱ的形成，这可能是由于Cdc42影响了Beclin1的相关信号通路，进而抑制了自噬体的形成，还有待于进一步的研究。本研究取得的成果为针对NA胞内转运的药物开发提供了新思路。同时，本项目在转基因动物模型方面取得的成果也为动物疫病的防控提供了新方向。