TLRs信号通路介导VIP调节肠粘膜免疫的分子机制研究

早期断奶仔猪肠道易受病原微生物侵害而发生疾病是制约规模化养猪业发展的瓶颈问题。因此，保护肠道屏障的完整性与肠道免疫功能的正常发挥对确保断奶仔猪健康至关重要。血管活性肠肽VIP在肠粘膜免疫中发挥着重要的调节作用。.申请者前期研究发现，VIP对E.coli, P. aeruginosa等病原微生物表现出较强的抗菌活性，VIP可通过TLRs介导的免疫应答缓解TNBS诱导的ICR小鼠结肠炎炎症反应。本项目从神经内分泌调节出发，通过建立体内外肠道细菌感染模型，探讨TLRs信号通路介导VIP调节断奶仔猪肠粘膜免疫的分子机制：（1）对肠免疫效应细胞分布和免疫相关分子表达的影响；（2）对肠道微生物区系的影响；（3）对TLRs信号通路的影响。为维持断奶仔猪肠粘膜正常结构和功能，减少断奶综合征的发生提供科学依据，为后续通过基因工程生产VIP以将其开发为高效、安全的仔猪防病保健添加剂奠定重要理论和前期工作基础。

本项目通过体内外实验集中对TLRs信号通路介导VIP调节肠粘膜免疫的分子机制进行了研究，取得的主要研究结果如下：.A．VIP的固相合成及其体外抗菌活性 采用Fmoc作为α-氨基的保护基，以逐个延伸的固相合成法成功合成了VIP，纯度为95.2%，相对分子质量为3326.5。血管活性肠肽对几种革兰氏阴性菌有不同程度的抑菌活性，其中对E.coli和P.aeruginosa的抑菌效果最好。.B．受大肠杆菌刺激后离体肠系膜淋巴结中VIP和免疫相关分子的动态表达 对照组离体肠系膜淋巴结中VIP阳性反应细胞数量较多，分布均匀，反应强度也较大，感染组肠系膜淋巴结中VIP阳性细胞呈缓慢的下降，CD68表达量升高，SYP的表达量也显著升高，CD25的表达量显著升高，浆细胞数量增多，溶菌酶显著升高。.C．VIP作用受抑后大肠杆菌刺激后离体肠系膜淋巴结中VIP和免疫相关分子的动态表达 VIP作用受抑后，感染组离体肠系膜淋巴结内CD25的表达量提高，浆细胞增殖得到促进，对溶菌酶和抗菌肽的表达没有显著影响，CD68和SYP的表达得到了一定提高。.D. VIP对TNBS诱导的结肠炎ICR小鼠和SD大鼠的免疫调节作用 建立TNBS诱导的ICR小鼠和SD大鼠结肠炎模型，研究了VIP的免疫调节活性，结果表明，VIP明显缓解了Pam3Cys或LPS处理的肠系膜淋巴结培养液中所诱发的炎症反应，降低了CXCL1的产生；同样，VIP处理通过降低TLR2/TLR4刺激后培养液中IL-12p70和IFN-γ水平来对抗Th1应答反应的诱导；此外，VIP处理恢复了TLR2和TLR4阳性CD4+CD25+T淋巴细胞的数目。.E．VIP对断奶仔猪肠道粘膜免疫的调节机制 建立E.coli K88断奶仔猪肠道感染模型，研究了VIP对其肠粘膜免疫的调节作用及其可能的分子机制：与感染组相比，一定量的VIP（10-8 M）能有效缓解E.coli K88所引起的断奶仔猪生长性能的下降和腹泻率的发生，保护了肠绒毛高度和隐窝深度，增加了回肠末端DC的数目和成熟度，提高了血清和回肠粘膜中部分细胞因子的水平，增加了结肠和盲肠内容物中菌群的多样性和有益菌的比例，VIP可能通过TLR2、TLR4、NF-κB和MAPK介导的信号通路调节断奶仔猪的肠粘膜免疫。.发表相关论文6篇，其中SCI收录5篇（1篇录用）。