耐热beta-半乳糖苷酶定向进化及分子动力学研究

Beta-半乳糖苷酶能催化乳糖或乳糖类似物中beta-1,4-糖苷键的水解反应而在乳品工业中具有重要用途。嗜热脂肪芽孢杆菌编码的beta-半乳糖苷酶(BgaB)是一种耐热性好、最适pH接近中性的细菌乳糖酶，相比目前在低乳糖奶生产中使用的酵母乳糖酶具有更优越的特性。本课题拟采用定向进化方法对该酶结构进行分子生物学改造，使之对乳糖分解的催化效率得到进一步提高以达到霉菌乳糖酶的比酶活水平。研究思路是采用大型计算机工具对酶分子的三维结构进行模拟以获得酶的催化结构域；以易错PCR随机突变、点饱和突变及分子改组等方法，建立突变体基因文库及针对乳糖水解活性的高通量筛选方法；结合计算机动力学模拟分析，研究作用底物在与酶的结合、催化过程中的分子能量状态，阐明该酶的催化活性与催化结构域空间构象之间的对应关系，为该类水解酶家族成员的催化机制研究提供参考，并为其它蛋白质的改造提供一种新的思路和方法。

嗜热脂肪芽孢杆菌编码的beta-半乳糖苷酶(BgaB)是一种耐热性好、最适pH 接近中性的细菌乳糖酶，相比目前在低乳糖奶生产中使用的酵母乳糖酶具有更优越的特性。本课题采用定向进化方法与分子动力学结合的方法对该酶结构进行分子生物学改造，经过本课题的开展，取得的主要研究成果包括：阐述了BgaB底物结合模式及主要催化氨基酸位点对活性的调控机制，获得了底物抑制作用显著降低的突变体1个(F341T)，水解活性提高突变体1个(E351R)；阐述了基于氢键网络调控的热稳定调控机制，获得热稳定性提高突变体1个(I42E)；阐述了功能氨基酸位点间的调控作用，并获得了功能累积突变体Y272A/E351R等。研究结果为该类水解酶家族成员的催化机制研究提供了参考，并为其它蛋白质的改造提供一种新的思路和方法。