基于磁性微球分离蚕蛹蛋白来源血管紧张素转换酶抑制多肽及其抑制机理研究

Angiotensin-converting enzyme (ACE)-inhibitory peptide has become potential alternative to health care products and hypotension drugs for its natural attribute.The magnetic microspheres coupling pig lung ACE were applied to protein of silkworm pupae (PSP) hydrolysate for ACEI separation and purification through affinity adsorption, aiming to provide a certain technical support and theoretical basis for ACEI purification. Structure identification and performance test of ACE-inhibitory peptide. was identified by MALDI-TOF-MS and automated edman degradation. RP-HPLC determination method of ACE-inhibitory peptide was established, and thermal stability and resistant of digestion were researched. On the basis of these studies, the inhibition mechanism and model of reactions between the ACE-inhibitory peptide and ACE were obtained using knowledge on enzyme kinetics and thermodynamics, molecular simulation, designated chemical modification, structure biological, etc. Based on the docking results, the key amino acids which affected the inhibitory active of ACE-inhibitory peptide were concerned, and modified peptides with different length and amino acid composition were researched. Finally, the inhibition mechanism and model of reactions between the ACE-inhibitory peptide and ACE were obtained.

血管紧张素转移酶（ACE）抑制多肽是降血压药物及保健品潜在的代替品之一。本项目以生物相容性良好的磁性微球作为固定化载体，偶联固定化猪肺粗提ACE作为亲和配基，快速筛选蚕蛹蛋白酶解产物中的ACE抑制多肽，采用飞行质谱、氨基酸N端测序等方法鉴定其组成结构，并对其热稳定性、抗消化稳定性等性能进行测定。在此基础上，应用酶动力学、等温滴定量热实验、分子模拟、化学定点改性和结构生物学等方法建立ACE抑制多肽与ACE的三维对接模型，确定蚕蛹蛋白ACE抑制多肽对ACE的抑制类型，并从分子水平上阐述ACE抑制多肽中各氨基酸残基对ACE抑制作用的影响，最终建立蚕蛹蛋白多肽抑制ACE模型。研究结果将进一步从分子水平上揭示ACE抑制多肽与ACE之间的相互作用关系，为最终明确抑制多肽对ACE活性的抑制机理提供理论支持。

该项目以广西桑蚕产业主要废弃物蚕蛹为研究对象，对蚕蛹蛋白酶解产物中的ACE抑制活性多肽进行分离纯化和抑制机理研究，得到如下结论：.（1）以蚕蛹蛋白酶解产物为研究对象，通过微滤、超滤、离子交换、凝胶层析和高效液相色谱法串联的方式分离纯化蚕蛹蛋白酶解液，获得具有高ACE抑制活性的蚕蛹蛋白多肽GNPWM（IC50=21.70 uM），再通过C端疏水性改造和N端逐一切除的方式，确定改性蚕蛹蛋白多肽GNPWW、NPWW PWW 和 WW也具有较高的ACE抑制活性（19.74、23.11、83.69、10.76 uM），最后再通过Sybyl分子对接的方式分析不同多肽与ACE的抑制机理。 .（2）因大多数ACE抑制多肽都为疏水性多肽，因此采用多巴胺为原料制备高疏水性微孔炭材料GPC，应用GPC纯化蚕蛹蛋白酶解液中的高疏水性多肽，通过液相色谱分离和飞行质谱鉴定获得高疏水性蚕蛹蛋白多肽GAMVVH（IC50=19.39 uM，包含5个疏水性氨基酸和1个碱性氨基酸）。然后再通过Sybyl分子对接和GROMACS分子动力学分析，发现多肽GAMVVH与ACE的复合体在15 ns内就已经稳定且回旋半径Rg一直维持在23.0 Å左右。最后通过对稳定后的多肽/ACE复合物对接结构进行PyMOL可视化分析发现ACE中Zn(II)四面体的破坏程度和多肽与Zn(II)之间的配位距离是影响ACE抑制活性的关键因素。.（3）由于疏水性多肽水溶性差不利于体内释放，因此考虑通过构建适度亲水表面的多孔炭材料吸附蚕蛹蛋白酶解液获得适度亲水蚕蛹蛋白ACE抑制多肽。再具体研究中，选择农业大宗生物废弃物-蚕沙为载体研究对象，通过原位活化的方式制备得到Fe修饰双功能蚕沙基多孔炭FL/Z-SE，通过液相色谱分离和飞行质谱鉴定获得高疏水性蚕蛹蛋白多肽RYL（IC50=3.31 uM，包含1个疏水性氨基酸、一个极性氨基酸和1个碱性氨基酸）。最后再通过Sybyl分析多肽RYL与ACE和底物HHL与ACE的分子对接构效关系，结果发现RYL与ACE中S1、S2和S’口袋中氨基酸残基之间的氢键作用是抑制ACE活性的关键因素之一。