天维菌素螺缩酮基团变构及其杀螨活性提高的分子机制

Tevemectin is a novel compound of sixteen-membered macrolides families produced by engeering streptomyces，which is similar structural features with Aevemectin but only was different in Spiroketal group. Our current research showed that Tevmectin exhibited increased acaricidal and pesticidal activity against Plutella xylostella and Tetranychus cinnabarinus in the greenhouse assay. In this proposal, we will perform the modification of spiroketal group of Tevmectin to produce the novel derivatives. All the synthesized compounds will be used to test the activity against Tetranychus cinnabarinus. For the further mechanism, Glutamate-gated chloride channel （GluCl）gene from T. cinnabarinus will be cloned and transferred to COS-7 cell for expression. Whole cell patch clamp technique will be used to test the ability of Tevmecin derivatives activating GluCl protein. The predicted results will contribute to the discovery of mechanism that the allosteric spiroketal increased the activity of Tevmectin against T. cinnabarinus. The Quantitative Structure-Activity Relationship （QSAR） model will be constructed based on the chemical construction, LC50(acaricidal activity), and the IC50(the binding ability with GluCl). In conclusion, the high-throughput screening platform will be established to screen the chemical targeting to GluCl. The novel molecular model based Tevmectin will contribute to the construction of new pesticide. The data will provide the clue for construction modification of macrocyclic lactone and genetic modification of Streptomyces.

天维菌素是由工程链霉菌产生的一种十六元大环内酯新化合物，和阿维菌素差异仅在分子中的螺缩酮结构不同，但对朱砂叶螨、小菜蛾等表现出比阿维菌素更高的活性。基于此，本项目将针对天维菌素螺缩酮基团进行修饰，构建结构新颖、多样的天维菌素衍生物；以朱砂叶螨为供试生物，系统测定各化合物的杀螨活性；克隆朱砂叶螨的谷氨酸配体门控氯离子通道（GluCl）基因，转入COS-7细胞并表达，采用全细胞膜片钳技术，研究天维菌素螺缩酮基团衍生物对朱砂叶螨GluCl的激活能力（IC50），解析天维菌素螺缩酮基团变构杀螨活性提高的分子机制。以化合物的结构参数、杀螨活性LC50、与GluCl亲和力IC50，建立QSAR模型。项目研究将建立以GLuCl为靶标的化合物高通量筛选平台，构建以天维菌素为基础的新农药分子模板，为十六元大环内酯类化合物的结构改造及链霉菌基因改造提供方向。

项目以十六元大环内酯类新化合物天维菌素（Tenvermectin）为研究出发点，对其生物活性、衍生物合成及作用机制进行了系统研究。天维菌素的室内杀叶螨活性为：Tenvermectin对朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus若螨和雌成螨均具有较高的毒力，其LC50分别为0.0105、0.1127 mg a.i./L，但其杀卵活性较差；田间试验表明，2%Tenvermectin微乳剂具有良好的速效性和一定的持效期，在8~40 mg/kg剂量下对二斑叶螨Tetranychus urticae和朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus在药后7 d的防效分别达88.15%、87.56%以上，药后14 d的防效分别为85.49%~92.64%、83.22%~92.77%，有效控制期在 14 d 以上，对作物和天敌安全。从天维菌素产生菌Streptomyces avermitilis MHJ1011发酵产物中分离鉴定了10个单体新化合物。利用天维菌素的微生物转化，将天维菌素作为底物，以红色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea ATCC 11635为转化菌株，对天维菌素进行生物转化，得到4″-O-glucosyl tenvermectin A，B。在tenvermectin活性修饰位点C-4''、C-4'、C-13、C-5等进行了结构改造，合成氨化，肟化等45个衍生物。以天维菌素为原料，建立了甲氨基天维菌素苯甲酸盐、乙酰氨基天维菌素的合成路线，并对新衍生物的结构采用1H NMR，LC-MS等进行了确定。测定了57个化合物对叶螨的活性，杀虫活性较好。天维菌素类化合物结构与杀虫活性的构效关系研究表明，C-13保持二糖基；C-5保持羟基；C-25保持2碳、3碳烷基链长或引入杂环基团；4''-引入脂溶性基团或其他利于母体化合物传导性的基团如氨基酸等，对天维菌素结构溶解性、传导性、稳定性及杀虫谱更有意义。.克隆获得了3条松材线虫谷氨酸氯离子通道基因序列。使用CHO、HEK 293、COS-7以及Sf 9细胞异源表达表达了3个谷氨酸氯离子通道基因。在特异性神经递质L-谷氨酸的刺激下，利用膜片钳技术测试3个谷氨酸氯离子通道基因的表达产物对L-谷氨酸的反应，结果显示均不产生反应；初步使用爪蟾卵母细胞异源表达表达了3个谷氨酸氯离子通道基因。