增强子上的遗传变异与肝癌发病风险的关系及功能机制研究

Enhancer is identified as a functional element that regulates gene expression. Recently, it has been reported that the majority of cancer-risk SNPs from GWAS mainly enriched in these regulatory sequences——enhancer. However, there have been little reserch to systematically identify HCC-risk SNPs located in enhancers until now. Our previous study has completed a HBV-related HCC GWAS and harvested about 4.8 millions SNPs for cases-control genotyping (Nature Genetics 2013). What′ more, several envidence indicated that some of SNPs associated HBV-related HCC was in enhancer regions. Continuousloy, we will firstly integrate genomic, epigenomic and transcriptome datas to fine mape these SNPs, and especially, to identify the HCC-risk SNPs located in enhancers. Because the precise mechanism of risk loci found in the previous GWAS remain largely unknown, our study plan to step forward into the function annotation of candidate SNPs. Thus, we would like to define potentail casual SNPs and genes through studying the effects of SNP on enhancer and the targeted genes′ role in HCC. Accordingly, our research will provide solid clinical benifits for HCC diagnosis and therapy.

增强子是一类重要的调控基因表达的功能性元件。许多研究表明基于全基因组关联研究（GWAS）鉴定的与癌症发病风险相关的SNP位点，更多地富集于增强子区域。但是至今没有研究系统地分析位于增强子上的SNP位点与肝癌发病风险的关系。本项目申请人所在课题组前期已经完成了一项乙肝相关肝癌的GWAS研究(Nature Genetics 2013)，获得了覆盖全基因组480多万个SNP位点的基因分型数据。而且，初步数据显示其中一些与乙肝癌变相关的SNP位点确实定位于增强子上。本项目将基于以上研究基础，首次通过整合基因组、表观基因组和转录组数据，系统全面地分析在增强子上的SNP位点与肝癌易感性的关系；并将通过探讨所鉴定的肝癌易感SNP位点对增强子功能的影响，及该增强子调控的下游靶基因在肝癌发生中的作用，深度挖掘易感基因位点的功能特性，从而找到肝癌新的潜在致病基因，为肝癌的临床诊断和治疗提供更有价值的理论基础。

肝细胞癌是一种最普遍的原发性肝癌，具有高发生率和高死亡率。目前，全基因组关联研究（Genome-wide association studies, GWASs）发现了多个与肝癌发病风险显著相关的SNPs。但是，很少对分子机制进行研究。.本项目首先整合我们的肝癌GWAS数据（包括1161个肝癌患者和1353正常人群）和肝组织的表达数据、组蛋白修饰及转录因子数据，通过生物信息学分析筛选位于增强子上的SNPs。基于此，获得了6个获选SNPs。接着在其他人群样本中进行两轮验证（第一轮包含576个肝癌患者和721个正常人群；第二轮包含3161个肝癌患者和4986个正常人群），结果显示rs73613962（T﹥G）与肝癌具有显著的相关性（OR = 1.41, 95%CI = 1.27-1.58, P = 6.02×10-10），它位于精氨酸甲基转移酶编码基因PRMT7内含子上。在后续实验中，首先通过双荧光素酶实验证实rs73613962所在区域是调控元件增强子，风险等位基因G相对于非风险等位基因T具有更强的增强子活性。另外，通过TCGA和GTEx中肝组织样品的cis-eQTL分析，发现该SNP与PRMT7的表达具有显著相关性；且PRMT7在风险等位基因G的样品中具有更高表达水平，与荧光素酶的结果相一致。此外，再通过CRISPR-Cas9和dCas9基因编辑，证实该区域是作为增强子调控靶基因PRMT7的表达。接下来，通过EMSA和ChIP实验发现转录因子HNF4A对含有风险等位基因G的序列具有更强的结合能力。在机制研究中，在肝癌细胞系中敲低靶基因PRMT7，细胞具有生长变缓、迁移和侵袭能力明显减弱的表型。其次，相对于正常组织，PRMT7在肝癌组织样本中高表达。而PRMT7的高表达与肝癌病人较差的预后具有正相关。进一步研究推测PRMT7可能通过影响p53信号通路中一些关键基因的H4R3me2s的修饰，参与肝癌的发生发展。.通过以上系统深入地研究，我们发现肝癌风险SNP rs73613962通过影响转录因子HNF4A的结合调控增强子的活性，进而影响靶基因PRMT7的表达，从而参与肝癌的病理进程。该项目为肝癌风险SNP的功能及机制提供了新的研究视角，也为肝癌的临床诊断和治疗提供了新的理论依据。