N6甲基腺嘌呤（m6A）识别蛋白YTHDF1调控鼻咽癌中EB病毒复制的机制研究

N6-methylyadenosine (m6A) and its protein machinery play vital regulatory roles in RNA virus infection and replication, such as HIV and ZIKA. However, how m6A modulation functions in DNA oncovirus is still largely unknown, especially in Epstein–Barr virus which’s infection is highly associated with nasopharyngeal carcinoma (NPC). Our data suggest EBV infection is linked to decreased expression of m6A reader protein YTHDF1 in NPC. Interfering YTHDF1 expression leads to increased EBV replication. YTHDF1 was further found to interact with ZAP which inhibits EBV replication. Thus we propose YTHDF1 plays an important regulatory role in EBV replication through recognition of m6A modification and subsequently recruits ZAP. This project is set out to apply m6A-seq, plus in vitro and in vivo models alone with clinical specimen, in order to further understand the molecular mechanism and biological function of how YTHDF1 regulate EBV replication in NPC via recognition of m6A modulation. The accomplishment of this project could provide new target for NPC therapy.

研究发现，N6甲基化腺嘌呤（m6A）及其蛋白机器在HIV和ZIKA等RNA病毒感染和复制中起到关键调控作用。EB病毒感染与鼻咽癌发生发展密切相关，但是m6A修饰在DNA病毒尤其是EB病毒（DNA肿瘤病毒）中的生物学功能和作用机制尚无报道，亟待研究。我们在预实验中证明，鼻咽癌细胞中m6A识别蛋白YTHDF1表达下调与EBV感染相关；敲减YTHDF1促进鼻咽癌细胞中EBV复制；同时YTHDF1招募ZAP，且过表达ZAP抑制鼻咽癌细胞中EBV复制。据此，我们提出科学假说：YTHDF1通过识别m6A修饰标记随后招募ZAP以发挥调控EBV复制的功能。本项目将在预实验基础上，采用m6A测序、RNA免疫沉淀测序等体内体外模型并结合临床标本，深入探讨YTHDF1识别m6A修饰标记而调控鼻咽癌中EBV复制的分子机制和生物学功能，及其在临床鼻咽癌防治中的价值。本项目的研究有望为鼻咽癌防治提供新的分子靶

鼻咽癌是广东地区最常见的鼻咽黏膜上皮恶性肿瘤，对经济和社会发展造成严重复旦。EB病毒的潜伏感染和自我复制在鼻咽癌的发生发展中发挥重要作用，但机制尚未完全阐明。N-6甲基化腺嘌呤（m6A）是广泛存在的一种mRNA表观遗传修饰，但其在EB病毒的复制中的调控作用尚无报道。在本研究中，通过MeRIP-seq我们首次在鼻咽癌肿瘤细胞系和原代鼻咽癌肿瘤细胞中鉴定了EBV转录组的m6A修饰谱，并鉴定了裂解基因BZLF1和BRLF1是EBV急性感染期中的特征m6A修饰基因。此外，我们还鉴定了BZLF1在EBV潜伏感染，急性感染和裂解感染期的m6A修饰丰度和修饰位点，发现病毒mRNA特异性的被高度m6A修饰。我们通过siRNA筛选发现并验证了敲减YTHDF1的表达能显著促进EBV的感染和复制。在表型上敲减YTHDF1能上调BZLF1和BRLF1的表达。在机制上，利用野生型和突变性报告基因载体，通过RNA免疫沉淀实验和RT-qPCR，我们发现YTHDF1通过识别BZLF1和BRLF1 mRNA上游区域的m6A修饰位点进而结合相应的病毒mRNA。通过YTHDF1 pull-down、免疫共沉淀实验和免疫荧光成像，我们找到YTHDF1相互作用蛋白ZAP，DDX17和DCP2。综上所述，我们的实验结果表明，EB病毒转录组在病毒感染和复制期间存在丰富且具有特征性的m6A修饰；YTHDF1通过识别病毒mRNA上的m6A修饰位点结合到关键病毒基因的mRNA，并招募RNA降解蛋白ZAP，DDX17和DCP2促进病毒mRNA的降解，抑制EBV的感染和复制。我们的研究立足于EB病毒转录组 m6A修饰，为鼻咽癌中EB病毒复制调控提供了全新的认知，为基于m6A相关蛋白YTHDF1对EBV感染治疗干预提供了依据。