基于纳米孔电信号腺嘌呤N6甲基化修饰识别方法研究及应用

DNA methylation is one of the important nucleic acidmodifications and plays an important role in the biological process. 5-hydroxymethylcytosine and N6-methyldeoxyadenosine are the two main ways of DNA methylation, and 5mC (5-methylcytosine) can be detected with high throughput and low-cost through sulfite treatment combined with second-generation sequencing technology.Currently, the low-cost and large-scale detection of 6mA detection is still a challenge.Nanopore sequencing technology offers anopportunityto detect 6mA modification with high-throughput and low-cost based on motif sequences. However, the general method of identifying 6mA modification with non-motifusing Nanopore technology has not been reported yet. Based on our resolved human 6mA profile, this projectfocuses ondeveloping the method of identifying DNA-6mA based on the electrical signal feature of Nanopore data: Firstly, the standard data set of the 6mA sites weregenerate and screen by multiple biological experiment technology, and the electrical signal feature of 6mA from raw data was extracted and used to establish a recognition network model of 6mA by deep learning. Then the new method will be applied toanalyze thedifferent development periods of model speciesArabidopsis thaliana and explore the dynamic change law of 6mA. This studywould provide a standard data set for the study of DNA-6ma method and technical support for large-scale detection of DNA-6mA modified sites.

DNA甲基化是重要的核酸修饰之一，在生命过程中发挥着重要作用。5mC和6mA是DNA甲基化的主要两种方式，其中5mC通过亚硫酸盐处理结合二代测序技术已实现高通量低成本检测，但目前6mA的低成本大规模检测仍是个挑战。纳米孔测序技术为高通量低成本的DNA 6mA修饰检测提供了可能，虽然该技术已有限地应用基于motif的6mA检测，但通用6mA（非motif）位点识别方法还未见开发。基于我们已解析的人类6mA图谱基础，本项目试图建立纳米孔的通用DNA-6mA甲基化修饰的识别方法：通过生物学实验产生和筛选6mA位点的标准数据集，提取6mA相关电信号特征，利用神经网络深度学习建立6mA电信号网络识别模型，从而对6mA进行准确高效的识别，并且应用该方法解析模式生物拟南芥不同发育时期的6mA图谱，寻找6mA的动态变化规律。本研究将为6mA方法研究提供标准数据集，为大规模修饰位点检测提供技术支撑！

DNA甲基化是重要的核酸修饰之一，在生命过程中发挥着重要作用。三代测序原始信号存在大量修饰信息，如何从三代测序数据识别DNA修饰信息是目前表观修饰识别的热点之一。本课题组基本按照研究计划中的研究内容和技术路线展开研究，取得了较好的研究成果。我们主要研究内容和重要结果及其意义如下：1）针对PacBio RSII的6mA位点假阳性高问题，我们建立了二代测序辅助识别可靠6mA位点的质控方法（MASQC），该方法显著降低了三代测序6mA位点的假阳性；2）针对原核生物Nanopore测序数据6mA检测方法缺失问题，我们构建了原始生物6mA标准数据集并设计了DeepMod深度网络模型，实现了精准检测原核生物6mA修饰；3）针对植物Nanopore测序数据Non-CpG修饰识别方法缺失问题，我们构建了拟南芥和水稻Non-CpG的5mC修饰位点标注数据集，提出了样本平衡和去噪策略，从而获得了高可信训练数据并训练DeepSignal模型，实现了Non-CpG修饰精准识别；4）针对高阶三维基因组Pore-C文库Nanopore测序堵孔问题，我们发现DNA交联的肽段致使Nanopore测序堵孔，从而提出了两次酶解或混合酶酶解的方案，实现高通量Pore-C测序技术（HiPore-C），并通过深入地生物信息分析揭示了三维结构单分子拓扑特征，与此同时，应用DeepSignal网络模型，建立了HiPore-C数据的5mC精准识别方法；5）针对三代测序Nanopore测序错误分布广泛且局部错误率高问题，我们提出了Nanopore渐进式校正方法和渐进式组装方法（NECAT），该方法可以将99%高错误区域校正恢复，使基因组完整性提高2倍以上；6）针对新冠康复期病人病情不稳定情况，我们构建康复期病人单细胞图谱，提示新冠患者出院后仍然是脆弱的，需要加强对康复期患者的医学观察，使治疗效果得到进一步巩固，该研究成果被广泛报道。本课题组共发表了学术论文5篇，其中JCR一区论文4篇，发表论文主要包括Nature Communications（3篇）、Cell Discovery， Frontier in Genetics等国际刊物，项目培养博士研究生1人和硕士研究生3人。